《Journal of Insect Physiology》：CRISPR/Cas9-mediated knockout of SPI51 reveals an essential role of protease inhibitors in silk fiber formation
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家蚕丝纤维中SPI51蛋白酶抑制剂通过调控纤丝蛋白（Fib-H/L/P25）的表达影响β-折叠含量和结晶度，从而决定丝纤维的机械性能。本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除SPI51，发现突变体丝纤维β-折叠含量下降（47.4%→41.2%），结晶度降低，纤丝横截面积减少（70.5%→53.8%），机械强度显著下降（p<0.0001），首次揭示蛋白酶抑制剂在丝蛋白合成与结构-性能关系中的关键作用。
作者：向珍、郭凯宇、奚嘉山、徐胜、段静敏、文珊珊、刘志成、王新茹、赵萍、张晓璐
单位：中国西南大学西部种质资源创造综合科学中心生物科学研究中心（重庆科学城），重庆 400715
摘要
蚕丝是一种天然蛋白质纤维，主要由丝素和丝胶组成，其中丝蛋白酶抑制剂也是其重要成分之一。然而，丝蛋白酶抑制剂对丝纤维结构和性能的影响尚未得到充分研究。在本研究中，我们重点关注了Kunitz型丝蛋白酶抑制剂SPI51——这是茧中含量最丰富的丝蛋白酶抑制剂。通过CRISPR/Cas9技术生成了SPI51的纯合突变体（SPI51KO），该突变体在33位氨基酸处发生提前终止翻译。敲除SPI51后，丝纤维的机械性能明显下降。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线衍射（XRD）分析表明，这种性能下降与β-折叠片含量减少及结晶度降低有关。形态观察显示，SPI51KO丝纤维中的丝素区域明显小于野生型。进一步的Western blot分析表明，敲除SPI51后丝素重链（Fib-H）、丝素轻链（Fib-L）和丝六聚体（P25）的量也有所减少，从而导致丝纤维层变薄，进而影响其结构和机械性能。我们的研究结果为理解丝腺中丝蛋白酶与丝蛋白酶抑制剂之间的平衡提供了重要见解，并首次揭示了丝蛋白酶抑制剂在丝蛋白合成以及丝纤维结构和性能中的作用。
引言
作为一种天然复合蛋白质纤维，蚕丝因其优异的机械性能和生物相容性，在生物医学材料（Croft等人，2023年；Wang等人，2025年）、高端纺织品（Lu等人，2024年）和药物载体（Xia等人，2025年）等领域具有广泛的应用前景。丝纤维的主要成分是丝胶和丝素，两者均在丝腺中合成，但具有显著的功能差异。其中，丝素主要在后部丝腺（PSG）中合成，占丝总蛋白含量的70%–80%（Lee等人，2021年）。丝素由三种核心亚单位组成：Fib-H、Fib-L和P25（Lu等人，2023年）。作为一种结晶性且不溶于水的纤维蛋白，丝素是决定蚕茧机械强度的关键因素，为蚕茧提供主要的结构支撑（Cui等人，2025年）。相比之下，丝胶在中部丝腺（MSG）中合成，约占丝总蛋白含量的20%–30%（Yuan等人，2024年）。丝胶的蛋白质组成比丝素复杂得多，包含五种已鉴定的丝胶蛋白（sericin1-5）（Dong等人，2019年；Guo等人，2022年），以及丝胶相关蛋白、丝蛋白酶抑制剂、酶等其他成分（Li等人，2016年；Cheng等人，2020年；Zhu等人，2020年；Jiang等人，2024年）。作为一种球形亲水蛋白，丝胶主要起到生物粘合剂的作用，将丝素纤维粘合在一起，从而保证蚕茧的致密性和结构完整性（Aad等人，2024年）。这些蛋白质共同维持了丝纤维的结构完整性和功能性能。
丝蛋白酶抑制剂已被证实是多种昆虫丝纤维中的重要成分，包括家蚕（Bombyx mori）、小菜蛾（Ephestia kuehniella）、斑蛾（Eumeta variegata）、Yponomeuta cagnagella、Plectrocnemia conspersa、Stenopsyche angustata、Hyalophora cecropia、Limnephilus lunatus和Andraca theae（Tang等人，2019年；Tsubota等人，2021年；Rouhová等人，2022年；Volenikova等人，2022年；Wu等人，2022年；Kmet等人，2023年；Rouhova等人，2024b；Rouhova等人，2024a）。其中，家蚕中的丝蛋白酶抑制剂研究最为深入。这些抑制剂可分为11个家族，主要包括Kazal、Kunitz、TIL、Serpin、PEBP、WAP、Pacifastin和A2M（Dong等人，2023年）。目前大多数研究集中在它们的抗菌活性上。从功能上看，这些抑制剂主要通过两种机制发挥作用：直接抑制病原体来源的丝蛋白酶活性（Liang等人，2024年），或与表面分子结合破坏病原体的完整性（Heng等人，2022年；Zhang等人，2024年）。然而，除了抗菌作用外，丝蛋白酶抑制剂在丝蛋白合成和丝纤维形成中的作用尚未被报道。Kunitz型丝蛋白酶抑制剂SPI51是蚕茧中含量最丰富的丝蛋白酶抑制剂（Zhang等人，2021年）。与大多数集中在中部丝腺（MSG）的抑制剂不同，SPI51在后部丝腺（PSG）中高表达，而PSG正是丝素合成的核心部位。其表达模式提示它可能在维持丝素稳态中发挥作用，但直接支持这一假设的实验证据尚缺乏。
为进一步研究SPI51在丝腺中的功能，本研究使用CRISPR/Cas9基因编辑技术有针对性地构建了SPI51的纯合突变体（命名为SPI51KO）。随后结合XRD、FTIR、DMA、SEM和Western blot等技术，从五个维度系统比较了野生型和SPI51KO突变体之间的丝纤维差异：结晶度、二级结构、机械参数、形态特征和蛋白质表达水平。分析结果表明，敲除SPI51后丝纤维中的丝素含量显著降低，β-折叠片含量和结晶度也显著下降，从而导致丝纤维的机械性能明显恶化。综上所述，以往的研究主要集中在SPI51的抗菌活性上，仅初步证明了其对丝素的保护作用，而未探讨其在丝纤维形成中的作用。本研究首次明确揭示了SPI51在丝素合成和丝纤维结构-性能关系中的核心作用，极大地扩展了SPI51的生物学功能范围，并为理解丝腺中丝蛋白酶抑制剂的多方面作用提供了新的分子框架。
实验材料
本研究中用于遗传操作的蚕品种为B. mori的Dazao品系，该品系由中国西南大学生物科学研究中心提供。幼虫在受控条件下饲养（温度26 ± 1°C，相对湿度70% ± 10%，光照12小时/黑暗12小时），并提供新鲜桑叶。
sgRNA设计、胚胎注射及阳性个体的筛选
选取了
SPI51第二个外显子内的特定靶点，对应的sgRNA序列为5′-TTCGGAAACCGCCCCTGCAA-3′。
纯合突变体的建立
为阐明SPI51在丝纤维结构和性能中的作用，我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功去除了B. mori基因组中的SPI51。设计了针对SPI51第二个外显子的sgRNA，构建了U6驱动的表达载体，并通过神经元特异性3×P3启动子控制GFP表达来筛选阳性G1代个体。随后将阳性转基因G1代个体与Hsp90-Cas9品系进行杂交。
讨论
丝蛋白酶抑制剂是鳞翅目昆虫丝纤维的重要组成部分。迄今为止，在蚕丝中已系统鉴定出29种丝蛋白酶抑制剂（Dong等人，2023年），它们属于Serpin、Kunitz、Bowman-Birk、TIL和Cystatin等家族。这些抑制剂可以分别抑制不同的酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶K和半胱氨酸蛋白酶。研究表明，在丝腺腔内...
结论
本研究利用CRISPR/Cas9技术生成了SPI51的纯合敲除突变体，导致其在aa33位点发生提前终止翻译。SPI51的缺失显著降低了丝素含量，丝素横截面比例从70.5%（WT）降至53.8%（SPI51KO）（p < 0.0001），同时主要丝素成分（Fib-H、Fib-L和P25）的表达也下调。FTIR分析显示β-折叠片含量从47.4 ± 2.0%显著下降...
作者贡献声明
向珍：撰写初稿、数据分析、概念构建。
郭凯宇：资金筹集、数据分析、概念构建。
奚嘉山：数据分析。
徐胜：实验方法设计。
段静敏：数据分析。
文珊珊：数据分析。
刘志成：数据分析。
王新茹：数据分析。
赵萍：监督指导、审稿与编辑、数据分析、概念构建。
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
本研究得到了国家自然科学基金（32200400）、重庆市自然科学基金（CSTB2025NSCO-GPX0519）和中央高校基本科研业务费（SWU-KR24017）的支持。感谢Dongchao Zhao和Zhangchen Tang在SEM测量方面的协助。
