《Frontiers in Immunology》：The transcription factor ZNF683 marks an exhaustion-like GZMB+CD8+ T cell in sepsis
脓毒症是一种由宿主对感染反应失调引起的危及生命的综合征，是全球范围内导致死亡的主要原因。脓毒症诱导的持续免疫抑制被认为是导致继发感染和不良预后的关键因素，然而，导致T细胞晚期功能障碍的机制仍未完全阐明。本研究旨在深入探索脓毒症中CD8+T细胞的功能状态，特别是与“耗竭”相关的特征，并寻找关键的分子标记和调控因子。
1 引言
脓毒症定义明确，每年影响全球约5000万人，导致约530万死亡，幸存者再入院风险增加，其中相当一部分源于新的感染。脓毒症发病机制复杂，涉及炎症失调、免疫功能障碍等过程，常以器官衰竭告终。初期的高炎症“细胞因子风暴”后，常伴随着一个长期的免疫抑制阶段，其特征是病原体清除能力受损和对继发机会性感染的易感性增加。这种免疫抑制涉及先天性和适应性免疫，可损害多种免疫细胞功能。
CD8+T细胞对于控制和清除细胞内病原体至关重要。然而，在脓毒症中，淋巴细胞凋亡导致循环T细胞显著减少，存活的CD8+T细胞可表现出早期和持续的功能障碍，这可能增加对复发和新发感染的易感性。T细胞耗竭是在持续抗原刺激（如慢性感染和癌症）下发展出的一种T细胞功能障碍状态，其特征是效应功能和增殖能力降低，以及抑制性免疫检查点受体表达增加。尽管靶向PD-1、TIM-3、LAG-3和CTLA-4等免疫检查点的脓毒症疗法临床证据有限，但大量临床前模型表明，阻断这些抑制性检查点可以恢复免疫细胞功能，增强宿主抗感染能力，并改善一些脓毒症模型的生存率。这些观察结果共同表明，耗竭样T细胞功能障碍是脓毒症相关免疫抑制和不良结局的一个促成因素。
转录因子ZNF683，也称为Hobit，参与包括自然杀伤（NK）细胞和CD8+T细胞在内的细胞毒性淋巴细胞的分化和组织驻留。在人类中，ZNF683优先在效应CD8+T细胞中表达，而非幼稚细胞或大多数记忆亚群。尽管在肿瘤微环境和病毒感染模型中发现ZNF683与抗肿瘤免疫和增强T细胞功能相关，但ZNF683在脓毒症中的作用及其与耗竭样CD8+T细胞功能障碍的关系仍不清楚。本研究整合了人类外周血单个核细胞（PBMC）单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据和临床相关的盲肠结扎穿孔（CLP）小鼠模型，结合流式细胞术和RNA荧光原位杂交（RNA FISH），以表征晚期脓毒症中的耗竭样CD8+T细胞状态，并探索ZNF683表达与T细胞功能障碍之间的关联。
2 材料与方法
2.1 原始数据来源
从基因表达综合数据库（GEO）获取了晚期脓毒症患者（诊断为脓毒症后14-21天）和健康个体的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。
2.2 10×scRNA-seq数据处理
使用Seurat软件包对来自脓毒症和健康对照样本的单细胞RNA测序数据进行了处理。经过严格的质量控制以去除低质量细胞和潜在的双联体后，保留了35,644个高质量细胞用于后续分析。通过基于典型相关性分析（CCA）的锚点整合工作流程对样本间批次效应进行了校正。随后进行缩放、主成分分析（PCA）、生成二维UMAP嵌入和基于图的聚类。基于典型标记基因，结合已发表文献和CellMarker 2.0数据库，对细胞类型进行了鉴定，包括T细胞、浆细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）、自然杀伤（NK）细胞、中性粒细胞、单核细胞、血小板、肥大细胞、常规树突状细胞（cDCs）和B细胞。在聚类过程中，表达两个或更多主要谱系标记的细胞簇被认为是潜在的混合谱系/双联体样簇而被移除。
2.3 T细胞再分析
基于典型标记物对T细胞进行了亚群分离。对亚群进行重新标准化，识别高变基因（HVG），执行PCA，并使用前50个主成分进行UMAP可视化和基于图的聚类。
2.4 CD8+T细胞的表型表征
为了表征CD8+T细胞的表型谱，我们选择了一组参考标记物，包括耗竭标记物（PDCD1、TIGIT、CTLA4、TNFRSF9、HAVCR2、LAG3）和细胞因子/效应分子（CST7、GZMK、GZMA、NKG7、IFNG、PRF1、GZMB、GNLY）。
2.5 KEGG和GO富集分析
使用Seurat的FindMarkers功能识别CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞与CD8_Tem_GZMB+LAG3-细胞之间的差异表达基因。随后，使用clusterProfiler软件包进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。
2.6 细胞间相互作用网络分析
使用CellChat推断T细胞亚群（CD4/CD8亚群）内部的配体-受体相互作用。计算通路水平的通信概率并进行汇总。根据汇总的通路概率生成网络可视化。
2.7 伪时间轨迹分析
使用Monocle2对三个细胞簇（CD8_Naive、CD8_Tem_GZMB+LAG3-和CD8_Tex_GZMB+LAG3+）进行伪时间分析，以研究脓毒症期间CD8+GZMB+T细胞的耗竭轨迹。将这三个簇之间确定的差异表达基因的并集定义为排序基因，然后使用reduceDimension和orderCells构建轨迹，并评估基因表达沿推断伪时间的动态变化。
2.8 动物实验和CLP诱导的脓毒症
将18只雄性C57BL/6小鼠随机分为三组（每组n=6）：假手术组、CLP组和治疗组。通过盲肠结扎穿孔手术建立脓毒症模型。假手术组小鼠仅接受开腹手术，不进行盲肠结扎或穿孔。治疗组小鼠在CLP前连续三天和CLP后连续两天通过尾静脉注射抗小鼠LAG-3抗体。所有分析均在CLP后48小时进行。在计划终点前发生了死亡：假手术组无死亡；CLP组有三只小鼠死亡（死亡率50%）；治疗组有一只死亡。从48小时的存活者中，为假手术组和治疗组随机选择三只小鼠进行终点检测以匹配组规模；对于CLP组，纳入所有存活小鼠。通过心脏穿刺收集血样；获取脾脏用于流式细胞术分析；收集肝和肺组织用于组织学分析。
2.9 流式细胞术
为了评估表面分子表达，用FITC抗小鼠CD45、APC抗小鼠CD3、PerCP/Cy5.5抗小鼠CD8a和PE抗小鼠CD223（LAG-3）单克隆抗体染色。对于细胞内染色，细胞被透化并与Alexa Fluor?700抗小鼠颗粒酶B重组抗体孵育。使用BD FACSCanto流式细胞仪进行分析，并使用FlowJo软件分析数据。
2.10 荧光原位杂交
取肝脏和肺组织，固定在4%多聚甲醛（PFA）中。将组织切成4μm切片，固定在载玻片上，用二甲苯脱蜡，并通过梯度乙醇系列（30-100%）再水化。加入含有1:20稀释的ZNF683 FISH探针的杂交液，载玻片在42°C下孵育过夜。对于RNA FISH，固定和透化的载玻片用HRP偶联的亲和素处理，随后进行TSA扩增以增强荧光信号灵敏度。用DAPI复染细胞核5分钟，并使用共聚焦显微镜检查载玻片。
2.11 统计分析
所有分析均在R（v4.2.3）中进行。对于单细胞RNA-seq分析，使用Seurat和相关R包进行统计检验，并适当应用多重检验校正；差异表达分析中，校正后的p值<0.05被认为具有统计学意义。对于小鼠实验，由于样本量小（终点读数每组n=3）且不能保证正态性，使用非参数检验。使用Kruskal-Wallis检验评估组间总体差异，然后使用Dunn事后检验并进行BH校正。
3 结果
3.1 通过scRNA-seq数据分析在脓毒症患者外周血免疫细胞中鉴定出十个不同的细胞群体
对来自GEO数据库的scRNA-seq数据集GSE175453进行分析，构建了单细胞水平的脓毒症转录组图谱。经过质量控制和归一化后，通过基于图的方法对细胞进行聚类，并通过UMAP可视化，产生了26个转录不同的簇。使用已知的细胞特异性标记基因进行后续细胞注释。一个点图显示了已鉴定细胞类型中关键标记基因的表达模式。基于这些注释，在外周血免疫细胞中鉴定出十个免疫细胞群体：单核细胞、T细胞、浆细胞样树突状细胞（pDCs）、血小板、肥大细胞、常规树突状细胞（cDCs）、自然杀伤（NK）细胞、浆细胞、B细胞和中性粒细胞。这些细胞群体的相对比例在健康对照和脓毒症患者之间存在差异。值得注意的是，与健康对照相比，脓毒症样本显示出T细胞比例显著减少，中性粒细胞相对增加，这与晚期脓毒症中深刻的免疫失调一致。
3.2 T细胞被分为七个主要亚群，在CD8+GZMB+细胞中出现了一个LAG3高表达的耗竭样群体
为了研究脓毒症中CD8+ T细胞耗竭，我们首先表征了T细胞景观。基于已建立的标记基因，将细胞聚为七个亚群：CD4_Naive、CD4_Tem_GPR183+、CD4_Treg_CTLA4+、CD8_MAIT_RORC+、CD8_Naive、CD8_Tem_GZMB+和CD8_Tem_GZMK+。其中，CD8_Tem_GZMB+亚群在脓毒症患者中优先出现，并显示出细胞毒性相关基因（包括GZMA、GNLY、FGFBP2和GZMH）的表达升高。
为了探索这个细胞毒性CD8+区室内的异质性，我们重新分析了CD8_Tem_GZMB+群体。经过重新聚类和降维后，细胞根据LAG3表达分成两个转录不同的亚组：CD8_Tem_GZMB+LAG3-和CD8_Tex_GZMB+LAG3+。LAG3高表达亚组相对于LAG3-亚组显示出不同的转录谱，与耗竭样状态一致。
3.3 CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞在晚期脓毒症中表现出细胞毒性程序减弱和耗竭样功能特征
为了进一步表征脓毒症中CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞的免疫功能，对CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞和CD8_Tem_GZMB+LAG3-细胞之间的差异表达基因进行了GO和KEGG富集分析。CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞中上调的基因主要富集在与能量代谢以及抗原加工和呈递相关的通路中，而下调的基因主要与细胞毒性效应功能相关。为了定量评估细胞毒性潜力，使用已建立的细胞毒性相关基因特征应用了UCell评分方法。与CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞相比，CD8_Tem_GZMB+LAG3-细胞表现出显著更高的细胞毒性评分，这与后者群体中多种细胞毒性基因表达减少一致。此外，密度可视化直观地显示了整个T细胞区室中GZMB与LAG3、PDCD1和ZNF683的单细胞共表达模式。这些图强调了LAG3、PDCD1和ZNF683在单细胞水平上的一致表达模式，表明这些标记物在T细胞内存在关联。
为了探索细胞间通讯，使用CellChat通过总结信号通路中配体-受体相互作用的可能性来推断通路水平的通信概率。我们将CellChat分析限制在注释的T细胞亚群，以检查T细胞内部的通讯模式。由此产生的通讯图显示，与其他T细胞亚群相比，CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞涉及的相互作用数量和强度都有所减少。此外，气泡图分析表明，CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞通过抗原呈递相关信号通路（包括HLA-A-CD8B、HLA-B-CD8B和HLA-C-CD8B）与其他T细胞亚群相互作用，这与持续的抗原暴露和潜在的抗原驱动激活一致。总之，这些结果描绘了CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞的转录、功能和通讯特征，为它们在脓毒症免疫环境中的独特作用提供了见解。
3.4 ZNF683在脓毒症中CD8+GZMB+T细胞的推断耗竭轨迹上逐渐上调
为了研究脓毒症期间CD8+GZMB+T细胞的耗竭轨迹，使用Monocle 2对三个簇——CD8_Naive、CD8_Tem_GZMB+LAG3-和CD8_Tex_GZMB+LAG3+——进行了伪时间分析。这些簇代表沿连续分化轨迹的不同免疫状态。CD8_Naive细胞主要位于早期发育阶段，而CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞定位于终末耗竭阶段。
沿伪时间轨迹在分支点1的分析显示，细胞毒性相关基因（GNLY、GZMA和GZMB）向CD8_Tex_GZMB+LAG3+分支方向逐渐下调，而抗原加工相关基因（如TAP1、B2M和PSMB9）在同一方向上调。代表性基因的表达动态显示，细胞毒性相关基因在CD8_Tem_GZMB+LAG3-细胞中高表达，在CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞中显著降低，而耗竭标记物（LAG3、PDCD1）在终末耗竭亚群中增加。
沿伪时间轨迹，转录因子ZNF683显示出向CD8_Tex_GZMB+LAG3+状态的连续上调趋势，而衔接蛋白SH2D1B（EAT-2）则下调。基因表达模式的可视化证实，ZNF683的表达随着耗竭过程而增加，而SH2D1B的表达在CD8_Tem_GZMB+LAG3-细胞中达到峰值，并向耗竭群体下降。总之，伪时间分析描绘了脓毒症中从幼稚到效应再到耗竭的CD8+T细胞的转录连续体，伴随着细胞毒性降低、抗原呈递增强以及ZNF683等调节基因的动态调控。
3.5 在CLP模型中，LAG3阻断调节耗竭样CD8+T细胞特征，并伴随组织ZNF683信号减少
先前的研究报告，以细胞数量减少和效应功能受损为特征的CD8+T细胞耗竭与脓毒症的不良结局相关。为了通过实验研究这一现象，我们使用盲肠结扎穿孔（CLP）脓毒症模型检查了具有不同耗竭程度的GZMB+LAG3+CD8+T细胞群体。对雄性C57BL/6小鼠进行CLP、假开腹手术或围CLP期抗LAG3治疗，所有组均接受标准的术后支持性护理。
为了进一步阐述CLP模型和治疗效果，我们总结了小鼠体重和生存结局并进行了可视化。在48小时的观察期内，Kaplan-Meier分析表明，与单独CLP组相比，抗LAG3治疗组的生存有改善趋势；然而，整体三组对数秩检验未达到统计学显著性。对于术后体重变化，我们应用了线性混合效应模型并进行BH校正事后比较。假手术组与CLP组和抗LAG3治疗组之间的体重变化存在显著差异。此外，在术后第1天，CLP组与抗LAG3治疗组之间存在显著差异，而第2天的组间差异显示出临界趋势。
鉴于LAG3已知在肿瘤和慢性感染中驱动和维持T细胞耗竭，我们评估了其阻断是否能调节脓毒症中的CD8+T细胞功能障碍。对从外周血和脾脏分离的存活CD45+CD3+CD8+白细胞进行流式细胞术分析显示，与假手术对照组和抗LAG3治疗组相比，CLP小鼠中LAG3+CD8+T细胞的比例显著更高。对于GZMB+CD8+T细胞，尽管在抗LAG3治疗小鼠中的比例高于未治疗的CLP小鼠，但总体差异未达到统计学显著性的常规阈值。关于GZMB和LAG3的平均荧光强度（MFI），观察到类似的组间模式。
为了评估脓毒症中组织水平的ZNF683 RNA信号，对假手术组、CLP组和治疗组的肝脏和肺组织进行了荧光原位杂交（FISH）。这些信号是组织水平的，不具有细胞类型特异性。结果显示，在假手术小鼠中检测到最小的ZNF683表达，而在CLP诱导的脓毒症小鼠中ZNF683表达上调。值得注意的是，与CLP小鼠相比，抗LAG3治疗与肝脏和肺中ZNF683信号强度的降低相关。总之，这些结果表明，CLP诱导的脓毒症与CD8+T细胞上LAG3表达增加以及肝脏和肺中组织ZNF683信号增加相关，而抗LAG3治疗部分减轻了这些变化，这与部分逆转耗竭样表型一致。
4 讨论
28天生存率传统上一直是评估脓毒症治疗疗效的关键终点。随着早期识别和重症早期管理的改进，更多的患者能够在急性期存活下来。因此，越来越多的注意力转向长期结局，特别是在发展为慢性危重症（CCI）的患者中，持续的免疫失调被认为有助于晚期发病率和死亡率。脓毒症与广泛的免疫细胞凋亡和淋巴细胞池耗竭有关，损害了宿主防御。在单细胞RNA测序数据集中，我们观察到多个T细胞亚群显著减少，这与晚期脓毒症的深度免疫缺陷状态一致。除了淋巴细胞减少症，剩余T细胞的功能障碍可能有助于晚期免疫功能障碍，而T细胞耗竭代表了一种合理的机制。我们承认，人类数据集代表晚期脓毒症（脓毒症后第14-21天），而我们的CLP实验捕捉的是急性期时间窗口（手术后48小时）。因此，跨物种比较应解释为耗竭样程序的趋同信号，而非直接的时间等同。
通过参考映射和单细胞聚类，我们将T细胞分类为转录不同的亚群，并发现在脓毒症样本中CD8+ GZMB+细胞优先出现。这可能与脓毒症相关的T细胞丢失不一致。然而，这可能归因于技术抽样，而非真实扩增。10x Genomics平台处理有限数量的捕获细胞，UMAP可视化代表处理后细胞池的组成，而非体内绝对细胞数。因此，这种模式应解释为谱系T细胞群体内的相对变化，而非CD8+GZMB+绝对计数增加的证据。在此基础上，我们对CD8+GZMB+细胞进行了重点分析，并解析出两个具有不同转录谱的亚群。差异分析强调LAG3是一个关键区分特征。鉴于LAG3在慢性感染和癌症中T细胞功能障碍的既定作用，CD8_Tex_GZMB+LAG3+亚群在晚期脓毒症中的优先出现支持了与该队列免疫抑制的潜在联系。
CD8_Tex_GZMB+LAG3+细胞的功能注释支持一种耗竭样重塑模式。GO/KEGG分析表明，与抗原呈递、MHC I类相关结合、氧化磷酸化和ROS相关通路相关的特征富集。同时，参与细胞毒性效应活性和免疫激活的基因相对减少。总之，这些特征与持续的抗原结合、伴随的细
