《Frontiers in Immunology》：Silencing of circRERE(4-5) inhibits ONECUT2-mediated tumorigenesis and metastasis in gastric cancer
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本文研究发现，环状RNA circRERE(4-5)在胃癌组织中高表达，并通过海绵吸附miR-571上调转录因子ONECUT2的表达，从而促进胃癌细胞的增殖、迁移和体内成瘤与转移。该研究不仅阐明了circRERE(4-5)/miR-571/ONECUT2轴在胃癌进展中的新机制，还通过靶向性反义寡核苷酸(ASO)在动物模型中验证了其治疗潜力，为胃癌的诊断标志物和抗转移治疗策略开发提供了新见解。
引言
胃癌是全球最常见的致命癌症之一，其高死亡率主要归因于肿瘤的转移性扩散。环状RNA(circRNA)是一类由前体mRNA通过反向剪接形成的共价闭合环状RNA分子，因其结构稳定性而在肿瘤发生和癌症免疫中扮演重要角色。在胃癌中，多种circRNA通过作为miRNA海绵、蛋白质支架或编码小肽等方式参与肿瘤进展，但驱动胃癌转移的circRNA谱系仍未完全阐明。本研究旨在通过circRNA表达谱分析，鉴定在胃癌转移中起关键作用的circRNA并揭示其机制。
circRERE(4-5)在胃癌中高表达并与进展相关
通过对GEO数据库中的circRNA微阵列数据集（GSE83521和GSE93541）进行分析，研究者发现了一个在胃癌组织和患者血浆中均显著上调的circRNA：circRERE(4-5) (circBase ID: hsa_circ_0009594)。在24对胃癌组织样本中，肿瘤组织的circRERE(4-5)表达水平显著高于癌旁正常组织。同样，胃癌患者血浆中的circRERE(4-5)水平也明显高于健康志愿者。进一步分析显示，血浆circRERE(4-5)水平与肿瘤大小和是否存在远处转移呈正相关。受试者工作特征曲线分析表明，血浆circRERE(4-5)在区分胃癌患者与健康对照者，以及区分有无远处转移的胃癌患者方面，都表现出良好的诊断效能。此外，在多种胃癌细胞系中，circRERE(4-5)的表达也高于正常胃黏膜上皮细胞系GES-1。这些结果表明，circRERE(4-5)的上调与胃癌的进展密切相关。
circRERE(4-5)的分子特征
circRERE(4-5)来源于RERE基因的第4和第5外显子，全长197个核苷酸。通过桑格测序验证了其反向剪接位点。使用针对反向剪接位点的发散性引物，只能在cDNA中而非基因组DNA中扩增出circRERE(4-5)，证实了其环状结构。RNase R核酸外切酶处理实验显示，circRERE(4-5)比其线性同源物线性RERE(lineRERE)和GAPDH mRNA更耐受降解，证明了其稳定性。使用转录抑制剂放线菌素D的处理进一步证实，circRERE(4-5)在细胞内的半衰期显著长于lineRERE。亚细胞定位实验表明，circRERE(4-5)主要定位于细胞质中，并且其出核转运依赖于exportin-2(XPO2)蛋白。
沉默circRERE(4-5)抑制胃癌细胞增殖和迁移
为了探究circRERE(4-5)在胃癌进展中的功能，研究者在AGS和HGC-27细胞中使用靶向其反向剪接位点的短发夹RNA(shRNA)敲低了circRERE(4-5)的表达，并确认该操作不影响线性RERE mRNA或其他RERE来源circRNA的表达。功能实验结果表明，敲低circRERE(4-5)能显著抑制胃癌细胞的活力（CCK-8实验）和克隆形成能力。同时，Transwell迁移实验和划痕愈合实验也显示，敲低circRERE(4-5)后，胃癌细胞的迁移能力明显减弱。相反，过表达circRERE(4-5)则会增强胃癌细胞的增殖和迁移能力。这些结果证实了circRERE(4-5)在胃癌中的促癌作用。
circRERE(4-5)通过海绵吸附miR-571上调ONECUT2
为阐明circRERE(4-5)的作用机制，研究者首先通过AGO2的RNA结合蛋白免疫沉淀实验，发现circRERE(4-5)能够与AGO2蛋白结合，提示其可能作为miRNA海绵发挥作用。利用circBank和circInteractome数据库预测，并结合RNA pull-down实验验证，最终确定miR-571是circRERE(4-5)的主要结合miRNA。亚细胞定位分析显示miR-571也主要位于细胞质，与circRERE(4-5)的定位一致，为两者的相互作用提供了空间基础。通过生物信息学工具预测并结合实验验证，发现转录因子ONECUT2是miR-571的下游靶基因。敲低circRERE(4-5)或过表达miR-571均能下调ONECUT2的mRNA和蛋白水平，而抑制miR-571则能上调ONECUT2。更重要的是，miR-571抑制剂可以逆转因敲低circRERE(4-5)导致的ONECUT2表达下降。序列比对分析显示，circRERE(4-5)和ONECUT2 mRNA的3‘非翻译区含有相同的miR-571结合位点。这些结果共同表明，circRERE(4-5)通过海绵吸附miR-571，从而解除miR-571对ONECUT2的抑制，导致ONECUT2表达上调。
circRERE(4-5)通过ONECUT2发挥促癌作用
为了确认ONECUT2是circRERE(4-5)下游的关键效应分子，研究者进行了拯救实验。结果表明，在敲低circRERE(4-5)的胃癌细胞中，过表达ONECUT2可以部分恢复因circRERE(4-5)敲低而受损的细胞增殖（克隆形成实验和CCK-8实验）和迁移能力（Transwell迁移实验和划痕愈合实验）。这证明circRERE(4-5)正是通过上调ONECUT2来促进胃癌的进展。
靶向circRERE(4-5)抑制体内肿瘤发生和转移
研究进一步在动物模型中评估了靶向circRERE(4-5)的治疗潜力。在皮下移植瘤模型中，瘤内注射靶向circRERE(4-5)的反义寡核苷酸(ASO-circRERE)能够显著抑制肿瘤的生长，使其体积和重量均小于对照组。肿瘤组织分析显示，ASO-circRERE处理组的肿瘤中，circRERE(4-5)和ONECUT2的mRNA水平显著降低，免疫组化染色也证实ONECUT2蛋白表达下降。在系统性转移模型中，通过尾静脉注射荧光素酶标记的胃癌细胞建立转移模型，随后静脉注射ASO-circRERE。活体成像结果显示，ASO-circRERE处理组的生物发光信号显著弱于对照组，表明转移被抑制。解剖后对肺组织的观察和计数也证实，ASO-circRERE处理组小鼠肺部的转移结节数量明显减少。这些体内实验结果有力地证明，靶向沉默circRERE(4-5)能够通过下调ONECUT2，有效抑制胃癌的体内生长和转移。
结论与展望
综上所述，本研究鉴定出circRERE(4-5)是胃癌中一个关键的促转移环状RNA。它通过充当竞争性内源RNA(ceRNA)，海绵吸附miR-571，从而解除对下游致癌转录因子ONECUT2的抑制，最终驱动胃癌细胞的增殖、迁移以及体内的成瘤和转移过程。该研究不仅揭示了circRERE(4-5)/miR-571/ONECUT2轴这一胃癌进展的新机制，还通过ASO在动物模型中验证了靶向该轴的抗肿瘤疗效，为将circRERE(4-5)开发为胃癌诊断的生物标志物和抗转移治疗的新靶点提供了重要的实验依据。未来研究将进一步探索circRERE(4-5)的上游调控机制，并在更大规模的临床样本中验证其诊断价值。
