天然除草剂先导物S-(-)-螺甾素的选择性、土壤行为与生物炭控释机制的综合评估

《Frontiers in Plant Science》：Integrated assessment of selectivity, soil behavior, and biochar-mediated release for the botanical herbicide precursor S-(-)-Spirobrassinin

本研究针对源自西兰花的天然产物S-(-)-螺甾素(S-(-)-Spirobrassinin)作为植物源除草剂先导物应用中的关键瓶颈，通过多学科交叉方法系统评估了其作物选择性、土壤环境行为及生物炭控释潜力。研究发现其对禾本科杂草具有优异防效且对谷子(Setaria italica)表现耐受，揭示了其在土壤中快速降解规律及对微生物群落的短暂影响，并借助分子动力学模拟从原子层面阐明了其在生物炭多孔表面的强吸附与受限扩散机制，为构建环境友好的智能除草剂系统提供了集成理论依据。

　　

1 引言

S-(-)-螺甾素是一种从西兰花中分离得到的吲哚生物碱类次级代谢产物，因其对杂草萌发和生长具有强抑制活性，成为极具潜力的植物源除草剂先导化合物。然而，将其转化为实际应用的农用化学品面临两大交织的障碍：首先，其生态安全性特征，包括对作物的选择性及其对土壤微生物群落的影响，仍 largely 未明确；其次，其在环境中潜在的快速降解风险威胁着田间药效，亟需开发一种能够增强其持久性的制剂策略。利用载体基质进行控释是缓解快速降解的可行途径。生物炭作为一种富碳多孔材料，因其高吸附容量和可调的理化性质，已成为一种备受关注的可持续农药载体。然而，针对S-(-)-螺甾素的靶向递送而合理设计生物炭，受到一个基本知识缺口的阻碍：即缺乏对其在生物炭纳米孔道内相互作用、吸附构型和扩散动力学的分子水平理解。

2 材料与方法

2.1 材料

目标化合物为S-(-)-螺甾素(C₁₁H₁₀N₂OS₂)。土壤样品采自内蒙古呼和浩特试验田。作物种子由内蒙古农业大学生物农药创制与资源利用自治区重点实验室提供。玉米秸秆生物炭购自中国河南郑州。

2.2 方法

2.2.1 种子萌发与选择性评估

选取高粱(Sorghum bicolor)、燕麦(Avena sativa)、谷子(Setaria italica)和欧洲油菜(Brassica napus)四种作物，以及田旋花(Convolvulus arvensis)、反枝苋(Amaranthus retroflexus)、黍(Panicum miliaceum)、稗草(Echinochloa crus-galli)和狗尾草(Setaria viridis)五种杂草进行筛选。采用培养皿滤纸法，在人工气候箱中培养7天后测量根长和芽长。

2.2.2 剂量响应生物测定与IC₅₀测定

设置五个浓度的S-(-)-螺甾素溶液，以苯磺隆(tribenuron-methyl)为阳性除草剂对照，蒸馏水为空白对照。测量黍和反枝苋幼苗的芽/茎长和根长，计算抑制率，并通过GraphPad Prism 8进行线性回归计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

2.2.3-2.2.7 土壤微生物效应实验

设立对照、生物炭、生物炭+S-(-)-螺甾素、S-(-)-螺甾素单独处理四组。培养14天后，提取土壤总基因组DNA，对细菌16S rRNA基因V3-V4区和真菌ITS1区进行PCR扩增及高通量测序。使用QIIME2和R软件包分析微生物群落的α多样性（如Shannon、Simpson指数）和β多样性，并通过主坐标分析(PCoA)可视化群落结构变化。

2.2.8 S-(-)-螺甾素土壤降解周期检测

将S-(-)-螺甾素溶液加入土壤后，于室温下储存。在第7、14、21、25、28天用色谱级甲醇提取化合物，通过高效液相色谱(HPLC)分析，建立标准曲线并计算土壤中残留量。

2.2.9-2.2.10 生物炭模型构建与模拟方法

使用Materials Studio软件，以七环石墨烯片单元随机组装成无定形纳米多孔碳结构来模拟生物炭的复杂结构。从PubChem数据库获取S-(-)-螺甾素分子结构并进行能量最小化。采用巨正则蒙特卡洛(GCMC)模拟方法，在290 K和0.1 MPa条件下模拟S-(-)-螺甾素在生物炭上的吸附，计算吸附热、吸附量及吸附等温线。基于平衡阶段的轨迹文件，计算径向分布函数(RDF)和均方位移(MSD)，分析分子扩散行为。

3 结果

3.1 S-(-)-螺甾素对杂草和作物的选择性筛选

培养皿萌发实验表明，S-(-)-螺甾素对高粱、燕麦和欧洲油菜幼苗的根长有显著抑制，但对谷子幼苗无显著影响，显示谷子对其具有耐受性。对于五种杂草，其根伸长均受到抑制，且对禾本科杂草（黍、稗草和狗尾草）的抑制效果强于对阔叶杂草（田旋花和反枝苋），表明S-(-)-螺甾素对禾本科杂草表现出更优的除草活性。

3.2 S-(-)-螺甾素的剂量依赖性除草活性

浓度梯度实验表明，S-(-)-螺甾素对禾本科杂草黍的根长抑制表现出更低的IC₅₀值（0.153 mg/mL），优于阳性对照除草剂苯磺隆。而对于阔叶杂草反枝苋，苯磺隆对其茎长的抑制IC₅₀（0.155 mg/mL）小于S-(-)-螺甾素。这些结果共同证明S-(-)-螺甾素对禾本科杂草的活性高于阔叶杂草。

3.3-3.4 S-(-)-螺甾素对土壤微生物的影响（门水平）

高通量测序分析显示，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、芽单胞菌门(Gemmatimonadota)和酸杆菌门(Acidobacteriota)是优势细菌门。与对照相比，单独添加S-(-)-螺甾素最显著地增加了变形菌门和放线菌门的相对丰度，而芽单胞菌门的相对丰度降低。生物炭与S-(-)-螺甾素共同添加则增加了土壤中芽单胞菌门的相对丰度，但降低了放线菌门的丰度。在真菌门水平，优势门为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和被孢霉门(Mortierellomycota)。与对照相比，添加生物炭和S-(-)-螺甾素显著增加了被孢霉门和担子菌门的相对丰度，而单独添加生物炭显著降低了子囊菌门的相对丰度。

3.5 S-(-)-螺甾素对土壤微生物群落α多样性的影响

处理14天后，向土壤中添加S-(-)-螺甾素显著降低了细菌的Simpson指数和丰富度。尽管生物炭的加入缓解了S-(-)-螺甾素对土壤细菌Shannon指数的影响，但并未减轻其对Simpson指数的负面影响。土壤真菌的α多样性指数也受到显著影响，Shannon指数和真菌丰富度均显著下降。然而，生物炭的吸附能力减轻了S-(-)-螺甾素对土壤真菌丰富度的影响。

3.6 S-(-)-螺甾素处理下土壤微生物群落的主成分分析

在主坐标分析中，不同处理下的细菌和真菌群落结构被清晰区分。S-(-)-螺甾素改变了土壤细菌群落结构，而添加生物炭使其群落组成更接近对照土壤，但这种变化在真菌群落中未观察到。OTU（可操作分类单元）分析表明，单独使用S-(-)-螺甾素处理的土壤产生了最多的细菌OTU（2911个），而S-(-)-螺甾素与生物炭联合应用产生了最少的OTU（2311个），提示部分细菌群落可能被吸附在生物炭表面。对于真菌群落，单独添加生物炭富集了305个真菌OTU，而当生物炭负载S-(-)-螺甾素后，富集的真菌OTU数量增加至376个，表明S-(-)-螺甾素-生物炭复合物有效增强了土壤真菌群落的丰富度。

3.7 S-(-)-螺甾素在土壤中的降解周期

通过高效液相色谱建立标准曲线并检测残留量。结果表明，S-(-)-螺甾素在土壤中易于降解。施用7天后，检测到的浓度为39 μg/mL；14天后降至12.83 μg/mL；21天后进一步下降至2.7 μg/mL。

3.8-3.10 分子动力学模拟：均方位移、径向分布函数与吸附负载分析

构建了以七环芳香单元为基础的多孔碳材料模型来模拟生物炭。均方位移(MSD)分析显示，在1 ns模拟时间内，S-(-)-螺甾素在生物炭孔道内的MSD随时间近似线性增加，从初始0 ?2升至1000 ps时的52.11 ?2，表现出典型的正常扩散特征，表明其在生物炭表面存在瞬态吸附-解吸动态平衡，扩散行为受孔道形态和吸附位点共同调控，是一个受限但持续的扩散过程。

径向分布函数(RDF)分析表明，在生物炭表面附近存在明显的吸附结构。第一个吸附层位于约0.93 ?处，而最强的吸附峰出现在约1.11 ?处，g(r)值高达16.01，表明此位置是S-(-)-螺甾素在生物炭表面最稳定的吸附位点，可能与表面缺陷、官能团或微孔入口等强相互作用位点有关。在1.5–3.0 ?范围内观察到的多个次级峰进一步证实了孔道内多层吸附或有序排列的特征。

吸附负载曲线分析显示，吸附过程在0-200,000 fs阶段相对较慢，随着模拟进行，吸附量逐渐增加并最终趋于稳定，表明系统达到了吸附-解吸平衡。最终稳态吸附量约为每个模拟盒子30-48个分子。曲线上升阶段的斜率对应吸附速率，初始阶段较陡的斜率表明S-(-)-螺甾素分子在石墨表面具有较快的扩散和吸附过程。

3.11 等量吸附热与比表面积分析

S-(-)-螺甾素在石墨表面的平均吸附热为25.185 kcal/mol，处于化学吸附与物理吸附之间的过渡范围，表明二者之间存在强相互作用，可能涉及π-π堆积和静电相互作用。最小吸附热为6.092 kcal/mol，对应系统中的弱吸附位点；最大吸附热高达44.292 kcal/mol，对应强吸附位点，如石墨烯层边缘的不饱和碳原子，这反映了石墨表面吸附位点的非均质性。生物炭模型的比表面积(SSA)经计算约为268 m²/g。

4 讨论

尽管源自西兰花，但S-(-)-螺甾素的除草选择性此前并不明确。本研究发现谷子对其表现出耐受性，且其对禾本科杂草的抑制强于阔叶杂草，剂量响应实验进一步证实了其对禾本科杂草更高的效力。其对禾本科杂草黍根长的强抑制作用优于传统除草剂苯磺隆，而对阔叶杂草反枝苋的效果较弱，这种差异可能归因于不同植物类型之间吸收或代谢途径的不同。

除草剂对土壤微生物的安全性是一个关键的环境与生态问题。研究发现，S-(-)-螺甾素显著增加了土壤中变形菌门和放线菌门的相对丰度。作为一种含氮有机化合物，S-(-)-螺甾素可被放线菌门等微生物分解代谢，这支持了其固有的生物可降解性和较低的环境持久性。变形菌门丰度的增加可能是土壤微生物群落为适应S-(-)-螺甾素存在而进行的自我调节反应。同时，生物炭与S-(-)-螺甾素的联合应用促进了土壤中真菌群落的种群规模，一方面表明两者联合使用对土壤微生物群落的影响相对有限，另一方面生物炭中易矿化的碳可能作为微生物碳源，刺激了腐生真菌的生长。

生物炭作为非极性吸附剂，在农业中作为缓释载体具有广阔应用前景。分子动力学模拟表明，生物炭对S-(-)-螺甾素表现出强吸附亲和力。RDF分析揭示了除草剂分子在碳表面约1.11 ?处存在显著的高能吸附位点。生物炭通过与芳香族除草剂的π-π堆积等方式相互作用，表明碳材料可通过多种非共价相互作用实现有机污染物的强固定。高比表面积为载药量提供了结构基础。MSD分析表明除草剂在碳孔内的扩散系数约为7.6 × 10^-6cm²/s，这种受限扩散主要归因于微孔的空间位阻和表面相互作用的共同效应，直接延长了分子在材料内的停留时间，有利于实现缓释。吸附曲线显示在碳材料上的吸附过程遵循“初期慢-中期快-后期平衡”的模式，这与扩散控制的孔填充机制一致。类似地，解吸过程通常表现为弱结合分子的初始快速释放阶段，随后是强结合位点分子的缓慢释放。这种多阶段释放行为在实际应用中具有实现“快速起效-持续维持”释放曲线的潜力，符合农业缓释制剂的设计要求。

与传统的聚合物载体相比，生物炭具有成本更低、环境兼容性更好、吸附容量更高等优势。然而，其释放曲线可能更为平缓，使其可能更适用于需要长期、稳定释放的场景。此外，通过原料选择和热解条件调控，可以对生物炭的孔结构和表面化学进行调节，从而使其释放行为具备一定程度的“可设计性”。

总而言之，本研究从田间选择性到分子机制，系统评估了S-(-)-螺甾素作为植物源除草剂先导化合物的潜力以及生物炭作为其载体的可行性。该化合物在强效抑制禾本科杂草的同时，对谷子影响甚微，显示出良好的选择性，并确定了其潜在的安全应用作物。从环境安全角度看，S-(-)-螺甾素，特别是与生物炭联用时，对土壤微生物群落结构的影响相对有限，可被特定细菌门代谢且未降低真菌多样性，显示出良好的环境相容性。在分子水平上，S-(-)-螺甾素在生物炭上的强吸附能力、受限扩散及多阶段动力学特性，共同构成了其控释应用的物理化学基础。这些发现为开发基于该天然产物的环境友好型智能除草剂系统提供了集成的理论依据。