《Frontiers in Microbiology》：Aspergillus oryzae solid-state fermentation enriches protopanaxatriol-type ginsenosides in Panax ginseng and confers cytoprotective effects in vitro
编辑推荐：
本篇研究建立并优化了以米曲霉（Aspergillus oryzae）对五年生白参进行食品级固态发酵（SSF）的工艺。通过正交实验优化，该过程可特异性地富集原人参三醇（PPT）型人参皂苷，如Rf和PPT分别增加了3.55倍和5.03倍。利用乙醇诱导的GES-1胃上皮细胞损伤模型进行评估，发酵提取物展现了剂量依赖性的抗炎、抗氧化及抗凋亡作用。本研究为开发具有胃保护潜力的功能性人参食品原料提供了一种安全、高效且可定向调控的生物转化策略。
1. 引言
人参（Panax ginsengC. A. Mey.）是重要的保健食品原料，其核心活性成分人参皂苷的药理作用已被广泛研究。原型人参皂苷（如Rb1, Re, Rg1）因分子量大、极性高，导致口服生物利用度有限，制约了其临床应用价值。因此，将丰富的原型皂苷转化为糖基化程度更低、生物活性更强、吸收性更好的稀有皂苷（如PPT, Rh1, Rh2）成为重要策略。这些稀有衍生物在神经保护、抗炎和胃保护等方面显示出更显著的生物活性。
目前产生稀有皂苷的方法主要有化学、物理、酶法和微生物转化等。与化学法选择性差、物理法通常作为辅助、酶法成本高昂且步骤复杂相比，微生物固态发酵（SSF）利用完整的植物基质，刺激高滴度水解酶的分泌，是一种资源效率高、可直接在原料内部进行生物转化的整合性生物方案。真菌的选择是转化特异性的关键。相比常用于转化原人参二醇（PPD）型皂苷（如Rb1到Rg3）的黑曲霉（Aspergillus niger），食品级的米曲霉（Aspergillus oryzae）拥有丰富的酶系，且据报道能优先转化PPT型人参皂苷，其GRAS（一般认为安全）状态也使其成为生产营养保健成分的理想候选。
本研究旨在填补这一研究空白，开发一个用于白参的米曲霉食品级SSF工艺，其目标有三：优化关键发酵参数以确定可重复的操作窗口；利用UPLC-QTOF-MS/MS技术重点表征PPT型皂苷的转化并量化标志性化合物；将组分变化与初步生物学评估相结合，在乙醇诱导的GES-1细胞模型中评估细胞毒性和胃保护潜力。
2. 材料与方法
本研究使用的米曲霉菌株（CCTCC No. AF 2018017）购自中国典型培养物保藏中心。五年生白参根购自吉林东北特产有限公司。所有实验均遵循严格的无菌操作和标准化流程。
2.1 米曲霉活化与发酵底物制备
冻干菌株在无菌马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）液体培养基中复壮，于28°C、140 rpm摇床避光培养24小时。经两次平板传代确保菌株纯度和活性后，用无菌0.05% Tween 80溶液收集孢子制备孢子悬液，用血球计数板测定孢子浓度并用无菌去离子水调节至5.7 × 106孢子/mL，作为接种液。白参根经干燥、研磨、过16目筛（粒径≤1 mm）后，称取25.0 g参粉，用无菌去离子水将底物含水量调节至60%（w/w），于121°C高压灭菌30分钟。冷却后，实验组按设计的接种量（v/w）接入孢子悬液，对照组接入等体积无菌水。所有处理单元置于高湿度（> 90%）环境中静态培养，每24小时观察真菌生长和底物形态。每组处理设置5个生物学重复。
2.2 单因素与正交实验设计
为优化SSF工艺，采用两阶段实验策略。首先进行单因素试验，考察发酵时间、接种量和温度三个关键参数对总皂苷和总糖含量的影响。初步确定合适范围后，基于单因素结果，采用正交试验设计[L16(43)]进一步评估因素间的交互作用并确定最优组合。正交试验中各参数设四个水平，通过分析各试验组合下发酵产物中总皂苷和总糖含量，计算极差（R）值和均值，确定最优工艺条件。最优组合经验证实验确认。
2.3 样品制备与化学成分分析
采用超声辅助甲醇水溶液提取发酵样品，提取液经旋转蒸发浓缩、复溶、离心和过滤后，制备成LC-MS分析样品。使用21种人参皂苷对照品，采用内标法通过UPLC-QTOF-MS/MS进行定量分析。色谱分离在ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱上进行，采用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液梯度洗脱。质谱采用电喷雾电离（ESI）负离子模式，MSE采集模式，扫描范围m/z 100-1500。通过比较保留时间、精确分子量、MS/MS碎片及与标准品和文献数据，对人参皂苷进行鉴定和定量。
2.4 细胞实验与生物活性评估
使用人胃黏膜上皮细胞系GES-1。通过CCK-8法评估细胞活力，确定乙醇诱导损伤的最适浓度和人参皂苷提取物的安全浓度范围。将细胞分为空白对照组、模型组（乙醇）、阳性对照组（维乐新200 μg/mL，奥美拉唑200 μg/mL）和人参皂苷提取物处理组（100, 200, 400, 800, 1600 μg/mL）。处理24小时后，评估细胞存活率。
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测细胞上清液中炎症因子（IL-1β, IL-8, IL-10, TNF-α）和氧化应激指标（SOD1, NO, MDA, GSH-Px）的水平。通过蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2以及抗氧化调节因子Nrf2的表达水平。
2.5 统计分析
实验数据以均值±标准差表示。使用SPSS Statistics 22.0进行统计分析，p < 0.05被认为具有统计学显著性。
3. 结果
3.1 工艺优化结果
单因素试验表明，发酵时间、温度和接种量均显著影响总糖和总皂苷含量。发酵8天时，发酵组总皂苷含量达到峰值，显著高于对照组。28°C和2.5%的接种量分别为最佳温度和最佳接种量。正交试验分析显示，三个因素对总糖和总皂苷含量的影响主次顺序为：发酵时间 > 接种量 > 温度。最终确定的最优发酵条件组合为A2B2C3，即发酵时间8天、接种量2.5%、温度28°C。在此优化条件下进行验证，发酵产物中总糖和总皂苷含量分别达到3.853 ± 0.025 mg/mL和1.687 ± 0.002 mg/mL，总糖含量较发酵前提高2.048倍，总皂苷含量提高至发酵前的1.448倍。发酵体系中的内源性糖苷酶和蛋白酶形成协同催化网络，通过降解人参基质中的多糖、蛋白质等大分子，显著提升了目标成分含量。
3.2 人参皂苷谱分析
UPLC-QTOF-MS/MS分析揭示了发酵前后人参皂苷谱的显著重塑。通过与标准品比对，共鉴定出18种人参皂苷。质谱分析表明，发酵过程发生了针对PPT型皂苷的靶向生物转化，可能遵循Rf → Rh1 → PPT的转化途径。这导致了此类生物活性化合物的显著富集，其中最终产物Rf和PPT的含量分别增加了3.550倍和5.032倍。Rf作为人参的特征标志物，其含量的显著提升突显了该发酵工艺在增强人参特征生物活性谱方面的潜力。
3.3 对GES-1细胞的保护作用
细胞活力：乙醇暴露显著降低了GES-1细胞活力。人参发酵提取物处理能以剂量依赖性的方式显著减轻这种乙醇诱导的损伤，恢复细胞活力。高剂量提取物的效果最为显著，甚至超过了阳性对照药。
抗炎与抗氧化活性：乙醇损伤显著提升了GES-1细胞中促炎细胞因子（IL-8, IL-1β, TNF-α）和抗炎因子IL-10的水平，同时降低了抗氧化酶（GSH-Px, SOD1）活性和NO水平。人参发酵提取物能以剂量依赖的方式显著抑制这些炎症标志物，并恢复抗氧化指标。高剂量提取物在降低MDA（氧化损伤标志物）积累方面效果最强，超过了阳性对照。这些结果共同证明了发酵人参提取物在保护GES-1细胞免受乙醇损伤方面具有强大的抗炎和抗氧化活性。
蛋白质表达分析：乙醇损伤显著上调了促凋亡蛋白Bax的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2和抗氧化调节因子Nrf2的表达。人参发酵提取物处理能显著逆转这一趋势，以剂量依赖的方式下调Bax并上调Bcl-2和Nrf2>的表达。高剂量提取物在调节这些蛋白表达方面表现出比阳性对照药更强的效力。
4. 讨论
本研究建立并初步优化了一个利用米曲霉对人参进行靶向生物转化的食品级SSF工艺。与通常转化PPD型皂苷的黑曲霉不同，本SSF工艺选择性地重塑了人参皂苷谱，导致PPT型衍生物的显著富集。定量分析显示，标志性皂苷Rf及其苷元PPT的含量分别增加了3.55倍和5.03倍。这种定向化学转化与功能增强直接相关：所得提取物在乙醇诱导的GES-1胃上皮细胞损伤体外模型中表现出显著、剂量依赖性的细胞保护作用。
工艺优化发现发酵时间是控制目标皂苷积累的关键因素，含量在第8天左右达到峰值后下降。这种动态曲线可能反映了微生物生长、酶合成和底物可用性之间的阶段性平衡。初始积累阶段可能与真菌生物量的增加以及分泌的水解酶（如β-葡萄糖苷酶、纤维素酶）的协同作用有关，这些酶促进了皂苷从基质中的释放并启动去糖基化。随后的下降表明，在延长发酵后，目标产物可能发生了进一步转化或降解。
代谢物分析支持从Rf经Rh1到PPT的顺序去糖基化途径。值得注意的是，与常用于转化PPD型皂苷的黑曲霉相比，本研究中使用的米曲霉菌株表现出特异性转化PPT型皂苷C-20位糖链的倾向。该途径中的一个关键步骤涉及α-L-阿拉伯吡喃糖苷键的水解，由于该糖苷键固有的稳定性，这通常被认为是人参皂苷生物转化中的限速步骤。本研究中观察到的Rh1向PPT的高效转化表明，在应用的发酵条件下，米曲霉很可能表达了强效的α-L-阿拉伯糖苷酶活性。
5. 结论
本研究建立并初步优化了在所述条件下利用米曲霉对人参进行靶向生物转化的固态发酵系统。UPLC-QTOF-MS/MS分析揭示了几种高价值稀有皂苷的富集，且有证据表明人参标志物Rf向原人参三醇（PPT）转化。发酵提取物在体外显示出增强的生物活性，且在测试浓度范围内对GES-1细胞无观察到的细胞毒性。这些发现支持了米曲霉介导的SSF作为生产高价值人参原料途径的潜力。然而，在作为营养保健食品应用之前，仍需进一步工作以验证相关的酶学机制，进行全面的安全性和霉菌毒素筛查，并在适当的动物模型中确认其功效和安全性。
