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这篇综述系统梳理了植物蛋白质相互作用（PPI）研究领域的最新方法学进展。文章重点评述了邻近标记（PL）、酵母三杂交（Y3H）、AlphaFold 3 (AF3) 及数据非依赖性采集质谱（DIA-MS）等新兴技术，对比了它们与传统方法（如酵母双杂交Y2H、免疫共沉淀Co-IP、双分子荧光互补BiFC等）的优劣势，为研究者如何选择、优化和组合这些工具，以最大程度覆盖植物蛋白质相互作用组、深入理解植物生命过程的分子机制并最终服务于作物改良，提供了实用的指导。
引言：植物中蛋白质相互作用网络的复杂性
植物是固着生物，必须感知和响应生物及非生物因素才能生存、适应和繁殖。蛋白质是协调植物功能和响应环境信号的核心执行者。植物拥有庞大的基因组和蛋白质组，例如拟南芥（Arabidopsis thaliana）约有27,500个蛋白质编码基因，而水稻（Oryza sativa）则更多。一个拟南芥根细胞平均含有约22亿个蛋白质分子，叶肉细胞中甚至可达约250亿个。这些蛋白质并非独立工作，它们之间以及与其他分子之间存在着动态的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI），这些相互作用网络构成了植物生命活动的基础。绘制大规模的PPI图谱，尤其是在应激响应的背景下，对理解植物生物学和农业应用至关重要。
经典技术：从遗传系统到活细胞成像
早期的PPI研究方法各有侧重，也各有局限。
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酵母双杂交与三杂交系统：酵母双杂交（Y2H）是1989年建立的经典方法，其原理是将目标蛋白（“诱饵”和“猎物”）分别与转录激活因子的DNA结合域和激活域融合。当两个蛋白在酵母细胞核内发生相互作用时，可重构转录因子并驱动报告基因表达。该方法简单、快速、成本低，但假阳性率高，且检测被限制在细胞核内。其改进版膜酵母双杂交（MYTH）系统可用于研究膜相关蛋白的互作。为提升通量，Cre报告子介导的酵母双杂交结合测序（CrY2H-seq）技术被开发出来，能够高通量绘制大规模相互作用组。酵母三杂交（Y3H）系统则引入了第三个分子（如蛋白质、RNA或代谢物）作为桥梁，可用于研究翻译后修饰（PTM）或代谢物依赖的PPI。
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免疫共沉淀与亲和纯化-质谱：免疫共沉淀（Co-IP）和亲和纯化-质谱（AP-MS）是捕获体内PPI的传统方法，被认为比Y2H更可靠。Co-IP通过特异性抗体检测已知蛋白质对之间的互作，而AP-MS则能通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）发现新的互作蛋白。两者的主要缺点包括细胞裂解可能因破坏天然细胞区室化而导致假阳性，以及难以有效捕获弱或瞬时的相互作用。活体交联是一种稳定PPI以捕获瞬时相互作用的方法。
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先进的荧光技术：活细胞荧光方法能够实时、高分辨率地可视化PPI。双分子荧光互补（BiFC）和分裂荧光素酶互补测定（SLCA）通过在蛋白质相互作用时重构荧光蛋白或荧光素酶的两个部分来检测互作。BiFC通过活细胞中的荧光成像检测PPI，而SLCA可根据发光信号强度对PPI强度进行定量。两者的主要优势是能在接近天然的细胞环境中实时监测PPI，但也都存在局限性，例如BiFC可能诱导不可逆的复合物形成，而SLCA需要外源添加荧光素底物。
对于真正的定量和动力学分析，荧光共振能量转移（FRET）是首选技术。它是一种距离依赖的能量转移过程，当蛋白质距离在10–100 ?范围内时，FRET可以可靠地检测蛋白质邻近性。其现代变体，如时间分辨FRET（TR-FRET）和荧光寿命成像显微镜-FRET（FLIM-FRET），提供了对动态PPI进行详细机理研究至关重要的定量数据。在植物中应用FLIM-FRET的一个挑战是植物组织强烈的自发荧光会干扰信号，但通过使用优化的荧光蛋白对（如mCitrine/mScarlet-I），已能在内源表达水平上直接检测免疫受体间的相互作用。
另一种技术是生物发光共振能量转移（BRET），其供体荧光团被生物发光蛋白（通常是荧光素酶）取代。虽然BRET受限于需要持续添加底物，且信号强度通常较低，但其不依赖外部激发，因此不受叶绿素自发荧光影响，在绿色组织中具有更高的信噪比，且光毒性更低。
新兴与改进的技术
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邻近标记：邻近标记（PL）通过在活细胞中使用工程酶（如生物素连接酶）对邻近蛋白质进行共价标记，随后再进行严格分析，从而克服了传统亲和纯化技术的许多局限性。它能够大规模发现体内稳定和瞬时的蛋白质相互作用。
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生物素连接酶系统：最早的BioID系统使用大肠杆菌（E. coli）生物素连接酶BirA的突变体，但标记活性低，可能需要长达24小时。为克服此限制，TurboID（TbID）和miniTurbo（mTb）被开发出来，能在几分钟内实现强大的生物素标记，在植物中被迅速采用。然而，TurboID系统的一个主要限制是背景生物素化水平升高，这降低了特异性并使得数据解读复杂化。分裂TurboID系统和光遗传学控制的变体（如OptoID）可以条件性激活生物素化，从而提高时空精度。
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基于Pupylation的相互作用标记：Pupylation-based interaction tagging (PUP-IT) 利用细菌PafA酶，将小蛋白Pup(E)标记到靶蛋白的赖氨酸残基上。由于pupylation在真核生物中不是内源的，且不需要添加外源底物，因此PUP-IT具有背景低、工作流程简单的优势。最近的研究表明，与TurboID相比，PUP-IT对诱饵-互作蛋白底物的富集程度更高，表明其可能具有更高的标记特异性。不过，PUP-IT组件的尺寸较大（约50 kDa），可能限制其进入某些相互作用位点。
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结构预测与网络建模：人工智能和深度学习（DL）被广泛应用于预测和绘制PPI。AlphaFold3（AF3）将建模框架扩展到蛋白质、DNA、RNA和广泛的分子相互作用。然而，AF3在预测涉及蛋白质内固有无序区（IDRs）的相互作用以及大型或植物特异性多亚基复合物（如免疫信号或光合作用组装体）时仍面临挑战。此外，特定的PTM（如独特的糖基化模式）尚未整合到AF3的相互作用模型中。
除了结构预测方法，基于序列的预测模型也被广泛开发。例如，D-SCRIPT和PIPR等深度学习模型可以直接从氨基酸序列预测相互作用可能性。特别值得注意的是，DWPPI是专门为植物PPI预测设计的深度学习模型，它整合了序列衍生特征和从植物PPI图谱中获得的网络嵌入，提高了在植物系统中的预测性能。蛋白质语言模型和图神经网络（GNN）框架等新方法，进一步提升了跨物种预测的泛化能力和网络层面的分析能力。
基于质谱的策略
数据依赖性采集（DDA）和数据非依赖性采集（DIA）是研究PPI的常用质谱（MS）方法。DDA在每个循环中选择并碎裂前10-30个最强烈的母离子，可对互作蛋白进行高置信度鉴定。相比之下，DIA在预定义的m/z窗口内碎裂所有母离子，提供了更全面的覆盖和更好的重复性。近年来，DIA蛋白质组学因快速质谱扫描周期和基于AI的MS2谱图预测技术的进步而广受欢迎。
在PPI分析中，尺寸排阻色谱（SEC）与基于DDA的定量蛋白质组学联用已被用于表征拟南芥中的蛋白质复合物。虽然这项研究证明了SEC在植物中分析相互作用组的可行性，但与较新的SEC-DIA方法相比，DDA可达到的蛋白质组深度仍然有限。目前，SEC-DIA MS在植物相互作用组研究中尚未有报道，但DIA-MS已成功应用于全面的植物蛋白质鉴定和定量。
虽然SEC-DIA MS前景广阔，但其在植物大规模PPI研究中的应用也存在权衡。SEC的分辨率相对较低；流体动力学半径相似的复合物可能共洗脱，难以区分不同的功能组装体。此外，植物细胞中RuBisCO的高丰度会掩盖低丰度信号蛋白的信号，需要采用去除策略，这可能无意中破坏所研究的PPI。DIA数据分析在处理多重碎裂数据、谱图库质量以及大量带有PTM的蛋白质形式方面仍面临挑战。
基于质谱的靶向肽段定量为研究PPI提供了另一途径。选择反应监测（SRM）或多重反应监测（MRM）利用三重四极杆质谱仪来监测和分离预选的母离子，提供对低丰度肽段的高灵敏度定量。平行反应监测（PRM）则采集靶向母离子的所有碎片离子，提供更高的特异性和定量准确性。MRMHR（MRM的高分辨率变体，类似于PRM）也已证明对植物中的蛋白质定量和验证非常有用。这些靶向方法与DIA-MS相结合，能够对复杂样品中的特定蛋白质伴侣（包括低丰度蛋白质）进行高选择性、高灵敏度和高准确度的定量。
讨论与展望
PPI研究领域经历了深刻变革。从AP-MS到PL的演进并非取代旧技术，而是研究工具包的不断扩展。改进的深度学习AI模型（如AF3）可用于蛋白质复合物预测。虽然AF3不能替代实验验证，但将其整合到PPI研究中，可以在计算信息的指导下优先选择实验目标，并辅助下游相互作用验证。另一方面，TurboID等PL技术可以先识别互作因子，再由AF3预测其相互作用机制。此外，SEC-DIA MS有望在植物研究中得到扩展，以捕获和定量蛋白质复合物。传统检测方法的优化、新一代技术平台与AI驱动的结构预测的协同整合，共同构成了一个强大的框架，将推动植物PPI研究不断前进。
