《Frontiers in Immunology》：A mouse model of allergic conjunctivitis with mucosal immune-related gene and circRNA dysregulation
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本研究利用豚草花粉诱导的小鼠过敏性结膜炎（AC）模型，通过转录组测序，系统揭示了结膜组织中免疫相关mRNA和circRNA的差异表达谱。研究发现，除了经典的Th2免疫应答，Th17/IL-17信号通路（涉及Tnfrsf4、Cxcl1、Lef1等关键基因）显著激活，并与特定circRNA（如Circ9626、Circ2598等）表达上调高度相关。该工作构建了circRNA-IL-17共表达网络，为深入理解AC的黏膜免疫特异性机制提供了新的转录组学图谱和潜在的治疗靶点。
引言与背景
过敏性结膜炎（Allergic Conjunctivitis, AC）是一种由花粉等过敏原引发的眼部炎症性疾病。尽管一般的过敏机制已被广泛研究，但眼黏膜免疫的特异性仍不清楚。豚草是菊科中重要的过敏原来源，在欧美约40%的特应性个体中引发花粉相关过敏反应。AC的全球患病率约为10%-20%，其主要症状包括眼红、瘙痒、烧灼感和过度流泪。传统上，AC的发病机制被归因于Th2介导的免疫反应失调，但眼表作为与外界直接接触的界面，其独特的免疫调节机制，如杯状细胞分泌免疫抑制因子、上皮细胞表达免疫检查点分子等，以维持免疫耐受微环境，仍待深入探究。近年来，环状RNA（circRNAs）作为一类共价闭合的非编码RNA，在多种生物学过程中成为关键调控因子，但在AC中的作用尚未被探索。
材料与方法
本研究经吉林大学动物伦理委员会批准，使用SPF级BALB/c雌鼠建立了豚草花粉诱导的AC小鼠模型。于第0天通过足垫注射进行致敏，从第10天开始，连续5天对每只眼睛每日滴加豚草花粉溶液。对照组接受等量的PBS。在激发后第14天，收集眼球连同眼睑、结膜组织及颈淋巴结（CLNs）进行后续分析。组织学分析包括H&E染色评估形态和甲苯胺蓝染色检测肥大细胞。利用在线工具ImmuCellAI-mouse基于转录组测序数据预测免疫细胞浸润。通过流式细胞术分析CLNs中的Th细胞亚群（Th1, Th2, Th17）以及结膜单细胞悬液中的Ly6G+中性粒细胞，并通过免疫荧光染色进一步验证中性粒细胞浸润。采用ELISA法量化眼表分泌物洗脱液和结膜组织匀浆中IL-17A的蛋白水平。为克服单个结膜组织RNA产量有限的问题，将两只小鼠的双眼样本合并形成一个RNA池，共构建5个生物学重复。使用去除rRNA的建库方法进行RNA测序。差异表达基因和circRNA通过DESeq2软件（fold change ≥ 1.5, p-value < 0.05）进行筛选。对差异表达RNA进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。通过计算皮尔逊相关系数（PCC）构建了circRNA–mRNA共表达网络，并使用RT-qPCR对关键的mRNA和circRNA表达进行了验证。
结果
3.1 AC小鼠模型的建立与评估
成功建立了AC小鼠模型。与对照组相比，AC模型组从第10天到第14天表现出明显的眼睑水肿和球结膜肿胀。H&E染色显示，AC模型组眼睑结膜有显著的炎性细胞浸润，并伴有病理性充血和结膜组织增厚，证实模型建立成功。
3.2 AC模型中的免疫细胞浸润
免疫浸润预测（ImmuCellAI-mouse）显示，与对照组相比，AC模型组结膜组织中CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著增加。流式细胞术分析进一步显示，AC模型组颈淋巴结中Th2细胞频率显著增加，同时Th1和Th17细胞群水平也升高。组织学分析证实了结膜组织中显著的肥大细胞脱颗粒。值得注意的是，对结膜单细胞悬液的流式分析显示，与对照组相比，AC模型组Ly6G+中性粒细胞大幅扩增。免疫荧光染色进一步证实了AC模型组结膜内Ly6G阳性中性粒细胞的密集浸润。ELISA分析表明，AC模型组眼分泌物洗脱液和结膜组织匀浆中的IL-17A蛋白水平均显著高于对照组。这些发现表明，除了引流淋巴结中传统的Th2主导反应外，Th17/IL-17轴的局部激活及随后中性粒细胞向结膜的募集，在AC模型的免疫失调和病理进展中起着关键作用。
3.3 AC中免疫相关基因的鉴定与功能分析
转录组分析显示，AC样本与对照样本之间存在明显的mRNA表达谱差异。以fold change > 1.5和p-value < 0.05为阈值，共筛选出645个上调基因和160个下调基因。GO富集分析显示，上调基因在生物过程如对刺激的反应、多细胞生物过程、信号传导、代谢过程、发育过程和免疫系统过程等方面显著富集。通过韦恩图分析差异表达mRNA与免疫相关基因（IRG）的重叠，揭示了28个上调的IRG和26个下调的IRG。
3.4 AC中免疫相关基因的GO和KEGG分析
对上调IRG的GO分析显示，它们在细胞因子介导的信号传导、细胞因子产生的正调控、对外部刺激反应的正调控、免疫反应的正调控等生物过程，以及免疫受体活性和细胞因子受体活性等分子功能中显著富集。KEGG通路分析表明，上调的IRG富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、PPAR信号通路和TNF信号通路等通路。而下调的IRG则主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用和趋化因子信号通路。热图进一步阐明了AC模型组中与Th1、Th2、Th17细胞及中性粒细胞相关的基因表达谱。
3.5 circRNA表达谱的特征
在所有样本中共鉴定出19,395个circRNA，其长度范围在80到超过3,000个核苷酸之间，大多数约为3,000个核苷酸。根据基因组来源，circRNA被分为六类，其中注释外显子（annot_exons）占比最高（83.71%）。染色体分布分析显示，对照组的circRNA数量略多于实验组。
3.6 AC中差异表达circRNA的功能分析
差异表达分析以FC > 1.5和p-value < 0.05为阈值，鉴定出64个上调的circRNA和96个下调的circRNA。对上调circRNA的宿主基因进行GO富集分析显示，它们在生物过程如细胞过程、生物调控、代谢过程、对刺激的反应、生物过程的正调控和免疫系统过程等方面显著富集。KEGG通路分析表明，上调circRNA的宿主基因在抗坏血酸和醛酸代谢、细菌入侵上皮细胞、PPAR信号通路和AMPK信号通路等经典信号通路中显著富集。而下调circRNA的宿主基因则主要富集于肌醇磷酸代谢、磷脂酰肌醇信号系统、T细胞受体信号通路和抗原加工与呈递等免疫调节相关通路。
3.7 AC中IL-17信号通路上调基因及其共表达circRNA的鉴定与验证
研究发现IL-17信号通路在AC模型中显著上调。选取了与该通路相关的三个基因Tnfrsf4、Cxcl1和Lef1作为候选基因进行分析。通过皮尔逊相关分析，研究了这些IL-17通路基因与差异表达circRNA表达水平之间的关系，并构建了共表达网络以可视化与IL-17通路相关基因正相关的circRNA。qPCR验证显示，与对照组相比，AC模型组中Tnfrsf4、Cxcl1和Lef1的表达水平均显著上调。此外，包括Circ9626、Circ2598、Circ1004、Circ8687、Circ7049、Circ0256和Circ4723在内的多个circRNA在AC模型组中也显著升高。这些结果表明，这些基因和circRNA可能参与了AC中观察到的IL-17信号增强。
讨论
AC传统上被认为是由Th2细胞主导的I型超敏反应。本研究结果与这一经典机制一致，但同时也揭示了Th17/IL-17信号通路在AC发病机制中的显著作用。研究发现，除了Th2细胞及其相关细胞因子外，Th1反应和Th17相关通路也被明显激活。特别是Th17细胞及其效应分子IL-17，通过促进中性粒细胞趋化和激活，在放大结膜炎症中扮演重要角色。转录组分析显示IL-17信号通路在AC模型组结膜组织中显著上调，关键基因Tnfrsf4（OX40）、Cxcl1和Lef1表达明显升高。ELISA和免疫荧光结果进一步在蛋白和细胞水平证实了IL-17A水平升高和中性粒细胞浸润。这些发现强调了Th17-IL-17轴在驱动AC炎症级联反应中的潜在作用。
circRNA作为一类稳定的非编码RNA，在免疫调节和炎症中的作用日益受到关注，但其在AC中的相关性此前尚未被探索。本研究发现多个在AC中显著差异表达的circRNA。功能分析表明，这些circRNA可能通过影响免疫反应、能量代谢和上皮屏障功能参与AC的发病。通过共表达网络分析，鉴定出多个与IL-17通路关键基因表达显著正相关的circRNA，如Circ9626、Circ2598等，提示它们可能作为IL-17信号网络的上游调节因子。
此外，研究还观察到AC诱导后结膜中多个抗菌肽相关基因显著上调，表明黏膜抗菌能力增强。Th17细胞主要通过分泌IL-17，在抗菌免疫中发挥关键作用。在过敏炎症期间，抗菌免疫反应的增强可能是结膜的一种特殊防御机制，旨在降低继发微生物感染的风险。临床证据也支持本研究发现，有研究报道AC儿童泪液中IL-17水平显著升高，且与疾病严重程度正相关。
结论
综上所述，AC是一种常见的眼表炎症性疾病。本研究利用豚草诱导的小鼠AC模型结合转录组分析，证明除了经典的Th2激活外，Th17/IL-17信号传导也参与了发病机制，其中Tnfrsf4、Cxcl1和Lef1等关键基因显著上调。此外，研究还鉴定出与IL-17通路激活显著相关的特定circRNA。这些发现提供了AC的全面转录组学图谱，并为未来的机制验证和治疗探索提供了有前景的靶点。
