《Frontiers in Immunology》：Integrated long-read transcriptomic profiling of peripheral blood from ankylosing spondylitis patients identifies regulatory shifts and core genes associated with programmed cell death
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本研究运用牛津纳米孔长读长RNA测序，首次在强直性脊柱炎(AS)患者外周血中绘制了转录本层面的转录组全景图，揭示了基因、剪接体、异构体等多个层面的广泛调控复杂性，鉴定出与程序性细胞死亡(PCD)失调相关的核心基因(如NAMPT、GATA2、DDIT3)，为理解AS的免疫失衡机制和开发新疗法提供了高分辨率分子图谱。
本研究首次应用牛津纳米孔长读长RNA测序技术，对6名强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis, AS)患者和6名匹配的健康对照的外周血转录组进行了全面分析，旨在解析在AS发病机制中日益受到关注、但转录层面全貌尚不清晰的程序性细胞死亡途径的调控网络。
转录组全景揭示AS复杂转录景观
主成分分析显示，基于转录本水平TPM值，AS与健康对照样本能清晰分离，展现出差异化的全局表达谱。研究共识别出81,940个转录本，对应25,343个基因，其中包括来自543个新基因的1,902个新转录本。值得注意的是，与健康对照组相比，AS样本中检测到的转录本（包括已知和新发现）总数略多。许多基因表现出高度的异构体多样性。功能富集分析表明，在AS和对照组中，与新转录本相关的基因都显著富集在与AS发病机制相关的生物学过程，包括炎症反应、先天免疫应答和肌动蛋白细胞骨架组织。这些发现凸显了AS中广泛的转录组复杂性，并提示新型异构体在疾病相关通路中可能具有功能相关性。
差异转录本与基因表达谱剖析
在转录本层面，研究识别出1,812个差异表达转录本，包括1,286个上调和526个下调的转录本。功能富集分析显示，上调的转录本显著富集于RNA聚合酶II介导的转录调控、凋亡信号、炎症、自噬和先天免疫激活等过程。而下调的转录本则富集于体液免疫应答、mRNA剪接与加工、抗病毒防御等过程，表明AS在转录本水平存在协调重塑，其特征是促炎和细胞死亡通路的激活以及免疫调节、RNA加工功能的抑制。在基因层面，共鉴定出1,088个差异表达基因，包括724个上调和364个下调基因，显示出向上调的偏向。上调基因主要参与RNA聚合酶II转录激活、凋亡、自噬和血管生成，而下调基因则富集于趋化因子信号、钙离子介导的途径、先天免疫抑制等过程。这共同表明AS中存在促进炎症、应激反应和免疫调节的全局基因表达转变。
程序性细胞死亡相关基因与转录本的差异表达
为探究PCD通路在AS中的参与，研究整合了差异表达转录本和差异表达基因，发现了508个在两个数据集中重叠的基因。这些基因显著富集于凋亡、钙信号调节、先天与适应性免疫应答等过程。进一步与涵盖12种细胞死亡的基因集交叉分析，发现相当数量的基因与凋亡、自噬、溶酶体依赖性细胞死亡、铁死亡和坏死性凋亡相关。其中，凋亡和自噬的关键调节因子FAS、FASLG和ULK1在基因和转录本水平均表现出显著且一致的差异表达，表明核心PCD成分的表达失调可能参与了AS的免疫和炎症失衡。
差异转录本使用揭示AS中的异构体转换
使用IsoformSwitchAnalyzeR中的DEXSeq进行差异转录本使用分析，发现了50个异构体使用显著不同的转录本。功能富集显示这些事件主要与先天免疫应答和RNA聚合酶II转录调控相关。与差异表达转录本/基因数据集整合，鉴定出4个重叠基因，包括LINGO3和SAMD9。在LINGO3中，尽管总基因表达在AS中降低，但优势异构体的使用比例增加，而另一种异构体的使用减少。在SAMD9中，基因和异构体表达水平在组间相似，但两种异构体的使用模式在AS和健康对照中呈现相反趋势，显示出明显的异构体偏好转换，且这些转换伴随着蛋白质结构域的差异。这些发现支持异构体水平调控是导致AS转录组重塑的另一个重要层面。
AS中的可变剪接景观
研究共识别出7种可变剪接类型，包括外显子跳跃、内含子保留、互斥外显子、可变5‘/3’剪接位点使用、以及可变起始/末端外显子，其中可变起始外显子最为普遍。经过统计筛选，保留了304个显著改变的剪接事件。可变剪接基因的功能富集分析表明其功能涉及mRNA剪接、转录调控、细胞应激反应、自噬和凋亡信号通路，提示AS相关的剪接改变可能影响关键的免疫和细胞死亡通路。具有代表性的疾病相关剪接事件包括在AS中，FCGR2B、TLR2和STAT5B等基因的外显子包含水平降低，这些剪接变化可能改变异构体结构和功能，影响AS中的免疫调节和炎症信号传导。
可变剪接与转录表达的整合揭示AS中PCD调控
将差异表达转录本与存在显著可变剪接事件的基因整合，发现了111个在剪接水平和转录水平均受影响的基因。这些基因显著富集于凋亡信号、先天免疫应答、mRNA加工、DNA损伤修复和转录调控等过程。与PCD基因集交叉比对显示，这些双重调控基因包括9个与凋亡相关、5个与自噬相关，以及其他参与溶酶体依赖性和细胞焦亡通路的基因，表明可变剪接可能与转录本水平表达变化协同调控细胞死亡相关基因，从而参与AS的免疫失调和疾病进展。
多层调控整合识别AS发病机制核心基因
通过整合差异表达基因、差异表达转录本和可变剪接事件，发现了26个在基因表达、转录本表达和剪接调控层面均表现出一致性失调的基因，突出了其作为AS发病机制核心候选者的潜力。其中，NAMPT(Nicotinamide Phosphoribosyltransferase)、GATA2(GATA Binding Protein 2)和DDIT3(DNA Damage Inducible Transcript 3)因其在所有三个调控层面一致且显著的失调而尤为突出。这些基因在PSI值上也显示出显著差异。基因水平表达分析显示NAMPT和DDIT3在AS中上调，而GATA2下调。转录本水平数据则确认了异构体特异性的表达变化。在功能上，这些基因均与PCD通路密切相关。此外，NAMPT和DDIT3的上调在另外两个独立的外周血转录组数据集(GSE205812, GSE25101)中也得到观察，进一步支持了它们在AS病理生物学中的潜在重要性。将本研究的差异表达基因/转录本集与两个已发表RNA-seq研究的差异表达基因集进行比较，发现显著重叠的基因富集于凋亡和转录调控过程，表明PCD相关的转录重塑是AS血液转录组学研究中的一个反复出现的特征。
综上所述，这项针对AS的整合性长读长转录组分析，系统地揭示了一个多层次的转录组失调景观，尤其聚焦于PCD通路。除了揭示差异基因和转录本表达，该研究独特地捕捉了重塑AS免疫信号结构的异构体特异性转换和剪接变化。研究发现，多种PCD机制在AS发病机制中转录组学上相互交织。其中，NAMPT、GATA2和DDIT3作为候选核心调节因子，处于炎症和细胞死亡的交叉点。尽管队列规模具有一定探索性，但多层分析整合、外部数据集验证以及具体可检验假说的提出，极大地增强了这些发现的生物学合理性。这些结果不仅增进了对AS发病机制的理解，也为未来的验证和靶向治疗探索提名了高优先级的目标。
