《Journal of Advanced Research》：Plasma-activated hydrogel promotes postoperative colonic anastomotic leak healing
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为解决术后结肠吻合口漏（CAL）这一导致高死亡率和高社会经济负担的严重并发症，西安交通大学的研究人员开发了冷大气等离子体（CAP）活化水凝胶（Hyd@CAP）。该水凝胶能在吻合口部位持续释放活性氧氮物种（RONS），在大鼠模型中显示出显著的抗菌、抗炎和促组织修复功能，并通过激活mTOR信号通路加速肠上皮细胞再生，为消化道术后吻合口漏的管理提供了一种新兴的有效治疗策略。
每年，全球有超过一百万患者因结直肠癌、炎症性肠病等接受肠道切除及吻合手术。尽管手术技术不断进步，吻合口漏（AL）的发生率依然居高不下，维持在3%到14%之间。这一并发症是胃肠道手术后最棘手的难题之一，它会引发严重的腹腔内感染、粘连形成，并导致高达18%的死亡率，给患者健康带来巨大威胁，同时造成住院时间延长、医疗费用增加、再入院和再手术率上升等一系列严重社会经济负担。
当前，针对结肠吻合口漏（CAL）的临床治疗策略主要依赖于腹腔引流和全身支持治疗。这些方法虽能部分控制病情，但由于难以清除的坏死组织和无法有效控制的腹腔感染，吻合口漏的愈合过程往往被显著延长，使得患者不得不持续承受健康损害和经济压力。现有疗法在恢复肠道连续性、降低吻合口张力和促进吻合口愈合方面存在明显局限，因此，开发更安全、更有效的治疗策略迫在眉睫。
近年来，冷大气等离子体（CAP）技术作为一种创新的生物医学治疗策略崭露头角。CAP是在接近环境温度和压力下产生的部分电离气体，能够产生活性氧物种（ROS）、活性氮物种（RNS）等混合活性物质，在抗菌、抗炎和促进组织修复方面展现出显著功效。然而，CAP产生的高活性物种在生理环境下会迅速降解，难以在吻合口部位实现有效、持续的作用，这限制了其体内应用。
为了解决这一瓶颈，研究人员将目光投向了水凝胶。水凝胶因其高吸水性、优异的组织相容性以及能模拟天然细胞外基质的三维多孔结构，成为极具吸引力的伤口敷料和药物递送平台。本研究创新性地将CAP与水凝胶相结合，开发出了CAP活化水凝胶（Hyd@CAP）。这种新型材料不仅能紧密粘附在吻合口部位，有效吸收渗出的肠内容物、隔离感染灶，还能作为稳定平台，持续释放CAP衍生的活性氧氮物种（RONS），从而延长治疗活性，增强整体疗效。
为了验证Hyd@CAP的效果，研究团队建立了一个关键的科学问题：这种新型复合水凝胶能否有效促进术后结肠吻合口漏的愈合？其背后的作用机制又是什么？为了回答这些问题，研究人员在SD大鼠身上成功构建了术后CAL模型，并开展了一系列深入的研究。
关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：
- 1.
动物模型构建：通过外科手术在SD大鼠结肠上制造切口并缝合，建立了术后结肠吻合口漏（CAL）模型，用于体内疗效评估。
- 2.
材料制备与表征：制备了冷大气等离子体（CAP）活化水凝胶（Hyd@CAP），并通过溶胀实验、流变学测试、扫描电子显微镜（SEM）分析等手段对其物理化学性质（如吸水性、微观结构、可注射性、粘附性）进行了系统表征。
- 3.
体内外功能评价：
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体内：通过大体观察、组织病理学（H&E和Masson染色）、免疫荧光/组化染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，评估了Hyd@CAP对吻合口愈合、炎症水平、胶原沉积、上皮细胞增殖和凋亡的影响。同时进行了腹腔渗出液细菌培养以评估抗菌活性。
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体外：使用人结肠癌细胞系HCT116，通过细胞增殖（CCK-8， EdU）、细胞周期和凋亡（流式细胞术）检测、以及蛋白质印迹（Western Blot）分析，探究Hyd@CAP提取物对细胞增殖、凋亡及相关蛋白表达的影响。
- 4.
机制探索：对吻合口组织进行了转录组测序（RNA-seq），通过基因集富集分析（GSEA）筛选潜在的关键信号通路。进一步在体内利用mTOR通路抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）进行干预实验，在体外通过联合使用TNF-α和雷帕霉素处理细胞，从正反两方面验证mTOR信号通路在Hyd@CAP促进愈合过程中的核心作用。
研究结果
Hyd@CAP的材料特性与生物相容性
研究人员首先对Hyd@CAP进行了全面表征。扫描电镜显示，CAP活化后的水凝胶具有更致密的微观结构。溶胀实验证明其具有优异的液体吸收能力，在PBS中的溶胀比高达922.2%。流变学测试表明其具有结构稳定性和剪切稀化特性，易于注射。更重要的是，Hyd@CAP表现出良好的组织粘附性，能够有效覆盖吻合口。细菌培养实验显示，Hyd@CAP处理组大鼠的腹腔渗出液中菌落数量显著减少，证明了其强大的抗菌活性。活/死细胞染色和CCK-8实验证实，与直接使用CAP相比，Hyd@CAP显著降低了细胞毒性，提高了生物相容性。这些特性为其后续的体内应用奠定了坚实基础。
Hyd@CAP显著促进大鼠术后CAL愈合
在SD大鼠CAL模型中，Hyd@CAP展现了卓越的治疗效果。术后第3天和第5天，对照组大鼠的吻合口处可见明显的粪便渗漏和广泛粘连，而Hyd@CAP组则无明显污染，粘连显著减少，荧光示踪剂通过顺畅，表明吻合口已实现功能性闭合。组织学（H&E）染色显示，Hyd@CAP组炎症浸润显著减轻，上皮增生明显。大鼠的体重恢复更快，疾病活动指数（DAI）和粘连评分也显著低于对照组和单纯水凝胶组。Masson染色和免疫荧光分析进一步证实，Hyd@CAP组具有更完整的黏膜结构、更有序的胶原纤维沉积、更广泛的上皮细胞覆盖（EpCAM阳性）以及更少的巨噬细胞浸润（F4/80阳性）和细胞凋亡（TUNEL阳性）。血清ELISA检测也显示，Hyd@CAP组炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平显著降低。
Hyd@CAP抑制细胞凋亡并促进增殖
为了探究细胞层面的机制，研究人员在体外用HCT116细胞进行了实验。蛋白质印迹结果显示，Hyd@CAP处理可上调细胞增殖标志物CyclinD1和CDK6的表达。当用TNF-α诱导细胞凋亡时，Hyd@CAP能逆转凋亡相关蛋白（如cleaved caspase-3， Bax/Bcl-2比值）的上调。流式细胞术证实，Hyd@CAP能显著降低TNF-α诱导的细胞凋亡率。EdU增殖实验和细胞周期分析则表明，Hyd@CAP能促进细胞DNA复制，并缓解TNF-α引起的G0/G1期阻滞，增加G2期细胞比例。这些结果综合表明，Hyd@CAP具有直接抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的能力。
转录组学揭示Hyd@CAP通过激活mTOR信号通路发挥作用
为了从全局视角探索作用机制，研究人员对吻合口组织进行了转录组测序分析。基因集富集分析（GSEA）结果显示，mTOR信号通路在Hyd@CAP组中显著富集并被激活。这提示mTOR通路可能在Hyd@CAP促进愈合的过程中扮演关键角色。
体内外验证mTOR通路的关键作用
为了验证这一发现，研究团队在动物模型中使用了mTOR通路特异性抑制剂——雷帕霉素。实验设置了四组：单纯水凝胶组、Hyd@CAP组、Hyd@CAP+雷帕霉素组、以及水凝胶+雷帕霉素组。结果发现，雷帕霉素的加入部分逆转了Hyd@CAP对吻合口愈合的促进作用。Hyd@CAP+雷帕霉素组的大鼠在体重恢复、DAI评分、粘连程度以及组织病理学评分等方面，均差于单独的Hyd@CAP组，这直接证明了mTOR通路的激活对于Hyd@CAP发挥疗效至关重要。
进一步的机制研究表明，Hyd@CAP处理能显著上调吻合口组织中mTOR及其磷酸化形式（p-mTOR）的表达。免疫荧光双标显示，mTOR/p-mTOR与肠上皮细胞标志物EpCAM共定位增强，说明mTOR通路在上皮细胞中被特异性激活。同时，Hyd@CAP处理减少了组织中的TUNEL阳性凋亡信号。在体外细胞实验中，Hyd@CAP也能减轻由TNF-α和雷帕霉素共同诱导的细胞凋亡。
研究结论与意义
本研究表明，CAP活化水凝胶（Hyd@CAP）代表了一种用于管理胃肠道术后吻合口漏（AL）的新兴治疗策略。其核心优势在于，水凝胶作为递送平台，不仅解决了CAP活性物种半衰期短、无法持续起效的难题，还能通过其物理屏障作用隔离感染、吸收渗出液。更重要的是，Hyd@CAP能够持续、局部地释放活性氧氮物种（RONS），这些RONS通过激活mTOR信号通路，发挥多重协同作用：抑制细胞凋亡、促进肠上皮细胞增殖与再生、降低局部和全身炎症水平、并发挥强大的抗菌效应。这种“载体+活性成分”的多功能一体化设计，在SD大鼠CAL模型中取得了显著的愈合效果。
该研究的创新性和重要意义在于：
- 1.
策略创新：首次将CAP技术与水凝胶载体有机结合，用于治疗深部脏器（肠道）的术后并发症，为AL的治疗提供了全新的思路和工具。
- 2.
机制深入：不仅验证了疗效，还通过转录组测序和药理抑制剂干预，深入揭示了mTOR信号通路是Hyd@CAP发挥促愈合作用的关键分子机制，为后续的靶点优化和药物设计提供了理论依据。
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转化潜力：研究初步验证了Hyd@CAP的安全性（生物相容性高，细胞毒性低于单纯CAP）和有效性，为其未来的临床转化和可能扩展至整个胃肠道的吻合口修复应用奠定了基础。尽管从动物模型到临床应用仍面临长期安全性评价、作用机制细节（如具体是哪些RONS如何精确激活mTOR）阐明等挑战，但本研究无疑为解决这一临床难题迈出了坚实而富有希望的一步。
