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这篇综述系统梳理了类器官（Organoids）技术在癌前病变（Precancerous Lesions）研究领域的最新进展。文章阐释了类器官如何通过精准模拟患者特异性遗传、表型及微环境特征，成为连接基础研究与临床转化的有力桥梁。作者重点介绍了类器官构建策略、验证框架及其在多维应用（如癌前演化机制解析、早期检测生物标志物发现、精准预防性治疗筛选）中的价值，并展望了结合CRISPR基因编辑与单细胞多组学等整合策略的前景，为该领域的研究范式转换提供了系统性的见解。
引言
癌前病变是肿瘤发生过程中的关键中间态，为早期检测和干预提供了重要窗口。然而，对其研究长期受限于临床样本稀缺、显著的分子异质性以及缺乏能够忠实模拟体内病理变化的模型。类器官技术的出现，以其能够保留患者特异性遗传、表型和微环境特征，并支持长期培养和功能研究的能力，为解决这些挑战提供了强大工具。
癌前病变的历史演变与定义
癌前病变的识别历经了一个多世纪的临床病理和生物学探索。20世纪初，病理学家观察到特定的上皮异常常先于浸润性癌出现，由此引入了“原位癌”（Carcinoma in Situ, CIS）的概念。到20世纪中期，“癌前病变”这一术语被正式提出，用于描述形态学改变、与恶性肿瘤风险增加相关的组织。世界卫生组织（WHO）肿瘤分类的出版，将这类病变系统归类为不典型增生、上皮内瘤变和CIS等。本文中，癌前病变被定义为具有进展为浸润性癌风险升高的、组织病理学上可识别的非浸润性上皮病变，涵盖从低级别不典型增生（Low-grade Dysplasia, LGD）、高级别不典型增生（High-grade Dysplasia, HGD）到CIS的连续谱系。然而，由于不同器官的生物行为差异，临床纳入标准各不相同，文中通过一张图表总结了不同器官的常见癌前病变。
癌前病变建模的类器官平台
正常、癌前与肿瘤类器官的阶段性差异
对跨多个器官建立的PDOs（Patient-derived Organoids）进行系统比较，可以观察到正常、癌前和癌类器官之间整体上存在阶段依赖性模式。正常类器官通常表现为囊状或出芽结构，重现上皮极性和分化程序，基因组稳定。肿瘤类器官则表现出深刻的形态异质性，缺乏有组织的组织结构，并显示出显著的基因组不稳定性。癌前类器官（Precancerous Organoids, PCOs）占据一个独特的中间生物学状态，其特征是结构复杂性增加，伴有早期基因组改变（如轻度染色体不稳定性），并表现出约束性扩张、克隆异质性增加以及对特定生态位因子的依赖性降低。这些特征使PCOs能够捕捉在正常类器官模型中难以观察、在肿瘤类器官中又被掩盖的早期选择压力、谱系可塑性和过渡状态。
PCOs建立与培养的常规方法
PCOs的建立依赖于干细胞培养技术，包括组织取样、干细胞分离和三维自组装。PDOs通常从病变组织通过机械-酶消化分离的成体干细胞/祖细胞生成。随着培养体系的不断优化，PCOs已成功从多个器官建立，最显著的是结直肠、食管、胃、肝和子宫颈。除了直接从病变组织分离，PCOs也可以通过基因工程改造正常类器官来系统生成。CRISPR/Cas9系统能够精确引入谱系特异性驱动突变以构建癌前模型。此外，化学诱导、辐射、慢性炎症和饮食干预等环境因素也参与癌前演化。类器官的长期稳定扩增依赖于Wnt/β-catenin和BMP信号通路之间的基本平衡。WNT3A和RSPO1维持干性和增殖能力，而Noggin抑制分化，共同构成了类器官培养所需的核心生态位成分。值得注意的是，PCOs表现出不同的生长因子依赖性，突变的逐渐积累会降低对生态位因子的需求。同时，细胞外基质（ECM）的物理化学特性通过机械信号显著影响类器官的发育。文中通过一张表格系统总结了目前已建立的癌前病变和癌前状态的类器官模型，表明食管、结直肠和宫颈PCOs的发展尤为突出，这主要归因于解剖可及性便于组织获取，以及临床管理倾向于监测而非干预。诱导多能干细胞（iPSC）技术为从难以获取部位生成患者特异性类器官提供了替代方案。
建立PCOs的新策略
尽管取得了相当大的进展，但传统类器官系统在复制复杂微环境和三维组织结构方面存在局限。近期的创新通过改善细胞异质性、优化仿生学和动态微环境调控来应对这些挑战。例如，为了模拟宿主-微生物相互作用，开发了开放表面模型和气-液界面（Air-Liquid Interface, ALI）培养系统，使得微生物能够直接接触上皮。整合非上皮组分对于捕获完整的癌前生态位至关重要，间接共培养系统揭示了免疫逃逸在癌前病变阶段即已开始。多细胞共培养平台将PCOs与阶段匹配的基质组分整合，研究表明直接的或空间邻近的共培养可诱导 robust 的上皮转变。此外，结合光遗传学和生物支架工程的“迷你结肠”平台，能够通过光诱导基因表达模块精确启动致癌信号，并支持长期培养而不需反复传代，从而实现对早期肿瘤发生轨迹的连续单细胞水平追踪。这些先进且标准化的类器官平台为解析癌前病变的核心机制提供了高精度的实验平台。
基于类器官的癌前演化机制解析
利用PCOs解析干性与克隆演化
肿瘤发生的两个核心框架是癌症干细胞（Cancer Stem Cell, CSC）理论和克隆演化理论，它们也被认为适用于理解癌前病变。类器官为观察和操控癌前生态位内的早期克隆演化和竞争提供了独特平台。对胃类器官的转录组分析显示，癌前干细胞（precancerous Stem Cells, pCSCs）与CSCs具有显著的表型相似性，但其关键区别在于pCSCs无法自主启动肿瘤发生。环境线索是进一步转化的关键触发因素。鉴于CSCs在治疗抵抗和肿瘤复发中的核心作用，靶向pCSCs已成为有前景的癌症预防策略。值得注意的是，癌前演化通常涉及从多克隆到单克隆的转变，这增加了pCSCs研究的复杂性。基因组不稳定性引发一系列分子事件，产生时空异质性，进而驱动癌前演化过程中的克隆选择。在类器官与野生型类器官共培养中，Apc缺陷的结直肠类器官通过分泌WNT拮抗剂，诱导邻近野生型类器官的分化和竞争性耗竭，迅速建立克隆优势。类器官保留了组织异质性和空间结构，使得长期追踪克隆演化成为可能。这些发现确立了克隆竞争是癌前期的核心机制，并表明靶向优势克隆可能为癌前病变提供新的预防和治疗策略。
利用PCOs解析癌前微环境重塑
癌前微环境（Precancerous Microenvironment, PME）是一个由具有遗传和表观遗传改变的上皮细胞、免疫和基质细胞以及不断重塑的ECM组成的动态生态系统。利用先进的共培养系统，研究者们已开始解码癌前微环境内的动态交互作用。
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炎症与免疫重塑：炎症是对组织损伤的关键防御，但持续的炎症刺激可转变为慢性炎症，从而创造有利于癌前病变发展的病理微环境。在巴雷特食管（Barrett's Esophagus, BE）中，胃食管反流引起的炎症驱动食管鳞状上皮向柱状上皮的化生转变。近期的BE类器官研究表明，促炎介质是疾病进展的核心。PCO模型揭示，癌前病变对微环境线索表现出不同的反应，从而影响细胞命运决定。重要的是，炎症重塑与早期免疫失调内在耦合。越来越多的证据表明，局部免疫细胞的组成和功能在组织学可见病变之前就已发生显著功能障碍。为了解码这种免疫失调，包含T细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的类器官共培养系统有效地模拟了体内免疫调节网络。例如，在源自胃类器官的极化上皮单层中，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）直接诱导上皮细胞早期上调免疫检查点分子PD-L1。进一步的类器官-免疫细胞共培养系统显示，阻断PD-L1在慢性感染下显著加剧了上皮损伤和细胞死亡。在结直肠腺瘤中也有一致的观察结果。总之，这些发现证实癌前生态位是一个炎症重塑和免疫失调汇聚的动态舞台。
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微生物组驱动的上皮重编程：作为人类微环境的关键组成部分，微生物组广泛定植于消化、呼吸和生殖道的粘膜表面。除了在营养代谢、免疫调节和屏障维护中的作用外，越来越多的证据表明微生物组结构和功能的改变可以显著影响宿主基因表达和细胞行为。类器官共培养模型揭示，微生物组依赖的成纤维细胞重编程促进了类器官扩增，突出了微生物失调通过微环境介导机制促进癌前组织重塑。尽管病原体如HPV和Hp分别被公认为宫颈和胃肿瘤发生的独立风险因素，但只有少数感染者会进展为恶性肿瘤。这种临床差异表明，全局性的微生物失调可能比单个病原体具有更大的致癌潜力。值得注意的是，类器官能够直接观察非经典致癌微生物如何扰动癌前病变中的上皮。一个突出的例子是宫颈癌研究，其中沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis, C. trachomatis）和HPV共感染表现出协同致癌效应。除了诊断特征，微生物代谢物对PDOs表现出直接的功能影响。总之，这些观察说明了类器官系统如何为剖析癌前病变中微生物组-上皮串扰提供了一个易于操作的平台。
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代谢重编程：代谢重编程在癌前期已显著显现。1920年代，Warburg首次描述了肿瘤细胞即使在有氧条件下也优先利用糖酵解产生能量，即瓦博格效应（Warburg Effect）。代谢组学分析已证实这种类似瓦博格的代谢谱存在于口腔、宫颈和乳腺的癌前病变中。线粒体重塑在癌前病变进展中起关键作用。例如，c-Myc在肝细胞PCOs中的过表达破坏了上皮极性和细胞间粘附，而超微结构分析进一步揭示了广泛的线粒体-内质网关联膜（Mitochondria-associated Endoplasmic Reticulum Membranes, MAMs）形成，损害了氧化磷酸化并增加了活性氧。鉴于靶向线粒体代谢在肿瘤治疗中的前景，MAMs可能为逆转癌前病变提供了新的干预靶点。癌前细胞的糖酵解转换具有双重目的：满足生物能量需求，同时为脂肪生成提供必要的代谢前体。然而，异常的脂肪酸代谢是否出现在癌前病变中尚不清楚。在从胃化生到增生的转变过程中，发生了显著的代谢转换：从糖酵解转向以单不饱和脂肪酸积累为特征的脂肪酸代谢。抑制脂肪酸去饱和酶可诱导增生类器官选择性凋亡，揭示了癌前细胞的代谢脆弱性。最近的证据也对传统抗氧化剂假定的癌症预防作用提出了挑战。尽管预期抗氧化剂能通过减少DNA损伤来维持基因组稳定性，但SELECT试验意外显示补充维生素E增加了前列腺癌风险。在维生素E处理的癌前类器官中观察到管腔填充，并伴有增殖标志物表达升高。机制研究将此归因于维生素E介导的脂肪酸氧化激活，它补偿了糖酵解抑制并驱动了前列腺PDOs中的异常增殖。全身性和局部性代谢紊乱同样是癌前病变的重要触发因素。在胃粘膜模型中，来自INS-GAS小鼠的类器官在脱氧胆酸处理后表现出明显的萎缩，并向肠化生样表型转变。此外，源自高脂饮食（High-Fat Diet, HFD）的游离脂肪酸通过诱导线粒体功能障碍和选择性耗竭胃类器官中的壁细胞，促进肿瘤发生，导致上皮结构重塑和SPEM样特征的出现。总之，这些基于类器官的研究强调了代谢失调是癌前病变中上皮重塑的早期且可操作的驱动因素。
类器官在癌前病变中的转化应用
早期检测与风险分层
癌前病变代表了一个关键阶段，早期检测和干预显示出降低癌症发病率的巨大潜力。然而，癌前病变的多克隆起源和异质性进展途径使得追踪克隆起源成为一项重大研究挑战。癌前病变的分子景观，包括遗传畸变和失调的蛋白质表达，为精准筛查提供了关键靶点。虽然许多干细胞相关标志物和驱动突变已被识别，但临床转化需要针对诊断指标进行严格验证，以避免过度诊断和过度治疗。常规内窥镜检查因对平坦病变分辨率低、假阴性率高而受限，正越来越多地被类器官平台补充。PDOs现在提供了一个优越的平台，保持了原生组织结构并允许快速扩增。例如，类器官和动物模型已验证OLFM4和TROP2是高度有效的诊断标志物。此外，类器官为实时评估癌前细胞中示踪剂摄取提供了高分辨率平台。将这些技术与传统内窥镜结合，有助于克服传统内窥镜在检测微观病变方面的根本局限性。液体活检显示出相当大的诊断潜力。然而，此类标志物的临床效用仍需在大型、多中心前瞻性试验中进一步验证。为了克服传统分析物的局限性，近期工作引入了类器官组织细胞外囊泡（Organoid-tissue Extracellular Vesicles, OTEVs）。鉴于个体和病变的异质性，整合年龄、家族史和多标志物加权评估已成为识别高风险癌前病变的有效策略。
治疗发现与干预
目前对癌前病变的管理主要依赖于手术切除、监测和局部治疗。扩大药物干预的一个主要障碍是缺乏能够忠实模拟体内分子病理学和组织微环境的临床前模型。类器官技术的最新进展通过建立保留原始病变遗传和表型特征的PDOs部分解决了这个问题，从而在药物筛选中提供了更高的临床相关性和预测准确性。在结直肠癌前病变研究中取得了显著进展，建立了大规模高风险结直肠腺瘤（High-risk Colorectal Adenoma, HRCA）类器官生物库并结合高通量药物筛选，鉴定出具有强效抗增殖作用的化合物。除了药物筛选，保留免疫微环境的类器官还促进了治疗性疫苗的开发。人工智能辅助分析对于PCO研究不可或缺，因为它能够客观检测细微的形态学变化，并定量追踪克隆异质性，从而捕获早期不典型增生轨迹和缓慢的演化动力学，这些是传统人工评估无法获取的。在PCO模型中，基于机器学习的图像分析促进了 robust 的分割、表型分类以及对类器官形态和生长动力学的定量分析。现有研究已确定了多个有前景的治疗靶点。尽管取得了这些进展，但仍需进一步精研研究系统：建立同基因正常类器官以验证靶点特异性，并系统评估药理安全性和治疗指数以指导临床转化。弥补这些差距对于推进癌前病变中基于类器官的靶向治疗至关重要。
整合技术用于基于类器官的癌前病变研究
用于建模和功能筛选的CRISPR-Cas9基因编辑
CRISPR-Cas9基因编辑系统的出现，彻底改变了具有明确遗传背景的PDOs的构建。由于其高效率、精确性和可编程性，该技术已成为肿瘤发生研究不可或缺的工具。通过在类器官中系统操控关键驱动基因，研究者可以精确再现癌前进展过程中突变的逐步积累，为功能验证提供了理想平台。除了对特定突变进行建模，基于CRISPR的基因组筛选已成为系统识别癌前进展关键驱动基因的强大工具。通过引入选择压力，基因编辑使具有促进增殖突变的类器官克隆在竞争中胜出，从而实现内源性自我选择。这种机制有效地识别了对其细胞表型和功能有重要影响的编辑事件。PDOs通常源自成体干细胞（Adult Stem Cells, ASCs），保留了其原生组织的分子和表型特征，同时表现出显著的基因组稳定性。这些属性使其成为CRISPR筛选以制定个体化治疗策略的理想平台。这些发现突显了基于类器官的CRISPR筛选如何协同体外系统的高通量能力与体内模型的病理相关性，建立了一个剖析肿瘤发生和推进精准医学的强大范式。
用于解析癌前演化的单细胞多组学
单细胞分析技术通过提供时空分辨率，彻底改变了类器官研究。这些工具能够全面研究细胞异质性和克隆演化动态，极大地提高了我们对类器官生物学的时空理解。传统的批量转录组分析本质上是跨群体的基因表达平均，无法捕捉细胞异质性。相比之下，单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够对PCOs内的细胞多样性进行高通量分析。类器官的全面质量控制需要多维评估，包括形态特征、基因表达谱和功能验证。随着癌前病变诊断标准从传统组织病理学发展到分子遗传学，scRNA-seq已成为分子质量评估不可或缺的工具。为了促进标准化，欧洲人类细胞图谱-类器官项目（HCA-Organoid Project）系统地表征了组织异质性、演化轨迹和微环境网络。通过生成标准化数据集和验证流程，该倡议不仅促进了高效的数据共享，而且为类器官验证建立了稳健的框架。令人兴奋的是，最近一项研究整合了54个scRNA-seq数据集，构建了一个跨越9个器官的人内胚层来源类器官细胞图谱，代表了评估类器官保真度方面的重大突破。此外，该团队开发了sc2heoca工具包，为类器官培养系统的标准化提供了一个创新工具。反过来，类器官也 reciprocally 验证了scRNA-seq的发现。
