《Journal of Materials Chemistry B》：Synthesis and characterization of an injectable telechelic material for the epiretinal delivery of retinal gene therapies
文章内容归纳总结
1. 引言
视网膜基因疗法在治疗视网膜疾病方面展现出巨大潜力，但现有递送策略面临挑战。目前主要方法包括玻璃体内注射、视网膜下注射和脉络膜上注射。玻璃体内注射因药物距靶组织扩散距离长、需穿越多种屏障，通常需要高剂量，并存在广泛的眼内暴露风险，可能导致眼内炎症。视网膜下注射需要手术诱导神经感觉视网膜脱离，可治疗体积有限，并存在形成黄斑裂孔、注射部位视网膜萎缩等风险。脉络膜上注射作为相对较新的策略，可能面临脉络膜毛细血管快速清除、免疫原性、基因治疗载体全身吸收较高等问题。
相比之下，基于材料的递送策略有望改进这些缺点。理想的递送平台应是无毒、生物相容的，能在释放治疗剂前对其提供保护，并在降解时不引起严重的免疫反应。具体到视网膜基因疗法，理想平台应是生物相容、可生物降解、易于装载、可注射且具有粘附性，以便以微创方式应用于视网膜表面。
共价交联水凝胶是应用广泛的聚合物网络，但其永久性的静态网络结构虽然能实现长期持续释放，却可能阻碍治疗剂在整个靶区域的铺展，且注射后机械性能可能发生不可逆变化。具有可逆连接的缔合聚合物网络则能改进静态网络的缺点，例如最近报道的“史莱姆”材料可用于递送皮肤溃疡的基因疗法，其形状可塑，可铺展，但注射后无法保留装载的药物，因此不适用于视网膜递送。
蠕虫状胶束是具有可逆连接的缔合聚合物网络的一个子集。当形成胶束的分子浓度达到临界点时，胶束纠缠成三维蠕虫状结构。由亲水主体两端接疏水端基构成的准互穿聚合物也能形成类似网络。这些胶束网络根据其机械性能可分为凝胶或粘弹性流体。准互穿材料复杂、可调的特性长期以来备受基础研究者关注，近年来已被提议作为治疗剂的递送平台。
在此背景下，本研究报道了一种由十八烷-聚乙二醇-十八烷（OPO）分子缔合形成的新型准互穿材料的开发。OPO最初被提议作为玻璃体替代物，并已证明与眼内环境相容。本研究改进了OPO的合成，并研究其作为递送平台的功效。表征和初步实验表明，OPO材料是体内递送应用的有力候选者。本研究进一步观察到，所述OPO材料无菌、可注射且具有粘附性，非常适合用于视网膜基因疗法的递送。
2. 实验部分
2.1. 材料
实验使用了聚乙二醇、1,4-二氧六环、甲苯、碳酸氢钠、异硫氰酸荧光素-葡聚糖、氢化钠、二氯甲烷、乙醚、磷酸盐缓冲盐水、硅胶、1-溴十八烷、盐酸、超纯水、真空过滤器等化学品。
2.2. OPO的合成与表征
2.2.1. OPO合成与纯化
在合成前，将聚乙二醇冷冻并冻干24小时。合成采用威廉姆森醚合成反应。简要步骤为：在氮气保护的施兰克线上，将干燥的聚乙二醇溶于干燥的1,4-二氧六环中，在温水浴中搅拌。分批加入氢化钠，搅拌1小时。同时，在氮气下将1-溴十八烷溶于干燥的1,4-二氧六环中。1小时后，将溴十八烷溶液通过插管滴加到聚乙二醇溶液中。反应瓶在室温氮气下搅拌20小时。
20小时后，将粗反应混合物从施兰克线中取出，滴加到乙醚中沉淀。通过真空过滤收集白色固体沉淀，并在真空下干燥3天。干燥后的固体溶于二氯甲烷，用盐酸酸提，用碳酸氢钠水溶液中和有机相。通过柱色谱法进一步纯化，用乙醚洗脱杂质，用二氯甲烷洗脱目标OPO产物，干燥后得到白色粉末。
2.2.2. OPO灭菌
通过将5% OPO水溶液通过0.2 μM尼龙过滤器进行灭菌。在无菌环境中，将过滤后的溶液分装到无菌锥形管中，在液氮中冷冻并冻干。将无菌OPO以白色粉末形式回收。通过在大豆酪蛋白消化肉汤和流体硫乙醇酸盐培养基中培养OPO来验证无菌性，孵育2周后无生长则视为无菌。
2.2.3. 核磁共振
在300 MHz布鲁克核磁共振波谱仪上，使用氘代氯仿采集1H NMR谱。
2.2.4. 体积排阻色谱
使用配备TSKgel-G3000H色谱柱的TOSOH HLC-8320GPC EcoSEC进行。测量在室温下以四氢呋喃为流动相进行。样品溶于四氢呋喃中。通过比较聚苯乙烯标准品，使用示差折光检测器测定数均分子量、重均分子量和分散度。
2.2.5. 傅里叶变换红外光谱-衰减全反射
使用配备金刚石晶体的尼高力iS50傅里叶变换红外光谱仪进行分析。每个样品以固体形式分析，在4000–450 cm-1范围内扫描64次。光谱通过将每个吸光度测量值除以最大吸光度值进行归一化。
2.3. 由OPO形成的准互穿网络的制备与表征
2.3.1. 使用OPO制备准互穿网络
通过将OPO重悬于水溶液中来制备准互穿网络。将OPO在锥形管或注射器中稀释至所需浓度，然后在离心机上以1811 RCF的转速离心90分钟。
为制备装载的OPO材料，将装载剂加入重悬缓冲液中。离心后，装载剂被捕获在整个OPO准互穿网络中。
2.3.2. 流变学
使用安东帕MCR 302流变仪进行流变测量，采用25 mm平行板和0.5 mm间隙。频率扫描测量在剪切振幅γ = 1%、振荡频率0.1–100 s-1下进行。剪切速率测量采用0.1–100 s-1的对数斜坡。除非另有说明，测量在室温下进行。在38 °C下的测量，仪器几何结构预热至38 °C超过15分钟。
2.4. 溶解与释放实验
2.4.1. 溶解实验
如2.3.1节所述制备OPO网络。将网络手动注射通过18G针头到底部闪烁瓶中，并在磷酸盐缓冲盐水中孵育。样品在摇床上轻轻晃动。在不同时间点从本体溶液中取出等分试样。通过测量吸光度并与外部校准曲线比较来确定OPO浓度。
2.4.2. 释放实验
如2.3.1节所述，通过重悬于异硫氰酸荧光素-葡聚糖溶液中制备装载异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料的OPO网络。将装载的网络手动注射通过18G针头到底部闪烁瓶中，并在磷酸盐缓冲盐水中孵育。有搅动的样品置于摇床上。无搅动的样品在取样前轻轻旋转。对于37 °C下的样品，缓冲液和摇床在培养箱中预热30分钟。在不同时间点从本体溶液中取出等分试样。通过测量荧光并与外部校准曲线比较来确定异硫氰酸荧光素-葡聚糖浓度。
2.5. OPO背衬层
设计了一个定制的两室设置来评估未装载的OPO背衬层对从OPO网络释放装载剂的影响。一个圆柱形样品池通过鲁尔锁T型接头连接到两个腔室。
如2.3.1节所述制备装载异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料的OPO和未装载的OPO。将装载的OPO手动注射到圆柱形样品池的一半中。将未装载的OPO手动注射到相对的一半中，使装载层和未装载层接触，且每层面向样品池的一个窗口。将样品池的每一面通过T型接头连接到不同的腔室。在每个腔室中加入磷酸盐缓冲盐水。将整个装置置于摇床上，以100 rpm轻轻晃动。在4小时内每30分钟从每个腔室取出等分试样，并在72小时后再次取样。测量荧光。通过比较外部校准曲线计算每个时间点异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料的质量。通过将每个时间点每个腔室中的异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料质量除以72小时后两个腔室中质量之和来计算相对质量。
2.6. OPO网络中AAV的稳定性与分布
2.6.1. AAV稳定性实验
如2.3.1节所述，在注射器中制备装载AAV的OPO样品。立即从装载的注射器中收集样品到离心管中，指定为t = 0 h，并储存在-80 °C。剩余的注射器样品在收集之间储存在4 °C。在后续时间点收集等分试样。分析前，将收集的装载AAV的OPO样品在室温下解冻，随后加热至95 °C直至OPO流体化。使用定量聚合酶链反应AAV滴度试剂盒分析每个样品的等分试样以评估最终AAV滴度。通过将每个样品中测得的滴度除以最初用于重悬OPO的AAV溶液的滴度来计算归一化滴度。
2.6.2. AAV分布实验
如2.3.1节所述，在注射器中制备装载AAV的OPO样品。为评估AAV在注射器内的均匀性，将装载AAV的OPO样品分成大致等体积的部分。将每个收集的部分转移到离心管中，并立即储存在-80 °C。分析前，将收集的装载AAV的OPO样品在室温下解冻，随后加热至95 °C直至OPO流体化。使用定量聚合酶链反应AAV滴度试剂盒分析每个片段的等分试样以评估最终AAV滴度。通过将每个样品中测得的滴度除以最初用于重悬OPO的AAV溶液的滴度来计算归一化滴度。
2.7. ARPE-19转导实验
从供应商处购买AAV。将ARPE-19细胞解冻到培养瓶中并维持培养。在传代25次时，将细胞接种到12孔板中并生长至汇合。
用AAV、装载AAV的OPO材料处理细胞，或不做处理。在培养箱中孵育48小时后，使用荧光显微镜对细胞成像。
使用ImageJ软件分析荧光图像。将RGB图像转换为16位图像。调整每张图像的阈值，以突出所有荧光细胞，并使用“二值化”功能将图像转换为黑白图像。使用“分水岭”功能分离重叠细胞。使用“分析粒子”功能计数荧光细胞，并通过测量每张图像的平均灰度值来确定荧光强度。还在Adobe Illustrator中手动计数荧光细胞。
2.8. 照片和视频
除非另有说明，所有照片和视频均使用iPhone 15 Pro Max以原始默认设置录制。
2.9. 统计分析
使用OriginLab软件进行统计分析。使用双尾分布的Student's t检验来比较有/无背衬层时释放的异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料相对质量的差异、装载AAV的OPO中测得的AAV滴度的差异，以及平均灰度值和细胞计数的差异。结果以显著性标准报告，当p ≤ 0.05时认为具有统计学显著性。
3. 结果与讨论
3.1. OPO的合成与表征
OPO分子的结构包含聚乙二醇链，两端接有十八烷分子。初步尝试合成OPO时存在重现性问题。增加了初步冻干步骤以去除起始试剂中的水后，能够可重现地合成OPO。纯化后，OPO以白色粉末形式储存。
由于打算在体内使用OPO递送治疗剂，在合成程序中增加了灭菌步骤。通过亚微米过滤的方法进行灭菌，能够一次性过滤大量OPO而不降解OPO聚合物。灭菌后，测得OPO产率约为30%。过滤后，在需氧和厌氧培养基中孵育2周均未观察到生长，结论是灭菌方案有效。
使用红外光谱表征OPO的化学成分。红外光谱中，OPO在约3300 cm-1处没有O-H伸缩带，证实了聚乙二醇上羟基的有效取代。
另外使用核磁共振和体积排阻色谱表征OPO。核磁共振测量结果证实了羟基的有效取代。核磁共振测得的分子量与OPO的预期标称质量一致，表明合成成功。体积排阻色谱测得的分散度较低，表明合成的聚合物分子量分布窄。
3.2. 由OPO形成的准互穿网络的制备与表征
OPO是一种准互穿分子，具有长的亲水主体，两端接有疏水部分。在水溶液中，疏水头部缔合成胶束样结构。随着OPO浓度的增加，这些胶束通过聚乙二醇主体连接，形成互连的三维网络。单个OPO链还可以悬垂或形成弹性无效的自环，或形成位于较大网络外部的花状胶束。
为形成缔合网络，将OPO重悬于磷酸盐缓冲盐水溶液中。在20%和26%浓度下，材料不透明，易碎，无法手动通过18G针头注射。在8%和14%浓度下，OPO材料透明并显示粘弹性。例如，材料倒置20分钟不迁移。20分钟后，8% OPO开始流动，而14% OPO保持原位。注射时，材料可铺展，便于沉积到目标表面。
由于用14% OPO制备的材料显示出有利于体内递送应用的定性特性，进一步表征了在此浓度下重悬的OPO。使用频率扫描流变测量评估OPO网络的机械性能。频率扫描测量表明，14% OPO是一种粘弹性流体。在测量的频率范围内，OPO材料表现出麦克斯韦行为，在较短时间尺度上主要为弹性行为，在较长时间尺度上为粘性行为，并具有表明单一弛豫时间的有限交叉频率。这些特性与由化学性质相似的胶束形成聚合物形成的其他准互穿材料所观察到的特性一致，从而支持了所示的网络模型。
这些特性进一步与由动态交联形成的瞬态网络一致。在室温下，将胶束结构连接到网络中的OPO分子不断交换。这些动态连接使OPO材料能够变形和铺展，同时保留装载的药剂。进一步假设，在注射时，网络结构坍塌，导致OPO材料流体化并通过针头。然后，在离开针头后，网络结构重建，OPO材料保留装载的药剂。
为评估这一假设，首先测量了OPO材料的粘度随剪切速率的变化。存在少量的低剪切增稠。这种行为在其他准互穿材料中也有观察到，可能由链拉伸和再捕获引起。在较高剪切速率下，存在显著的剪切稀化，表明随着网络结构坍塌，材料流体化。
通过测量通过18G针头注射后的频率扫描流变学，验证了OPO网络结构在流体化后重建。频率扫描流变性能在注射后保持一致。重要的是，OPO材料在注射前后表现出相同的麦克斯韦行为，表明动态的准互穿网络结构在两种情况下都存在。注射后保留装载的药剂将在后面进一步讨论。
进一步评估了OPO材料在体温下的流变性能。在38 °C时，频率扫描行为向右移动，反映了动态连接网络弛豫时间随温度升高而缩短的预期。麦克斯韦行为的保持表明尽管温度升高，网络结构仍然完整。
尽管存在许多旨在量化准互穿材料流变行为的模型，但这些模型通常依赖于唯象参数，对这些材料中发生的分子机制的全面理解仍然难以捉摸。未来的研究将通过测量聚合物浓度和疏水端基长度等参数如何影响材料的流变行为，进一步探究这些参数。
然而，这里展示的流变测量证明了对于预期应用以递送视网膜基因疗法至关重要的某些特性。OPO材料由准互穿网络形成，其中弹性缔合断裂并重建。注射时，材料流体化，使其能够被推过针头，便于沉积到视网膜表面。注射后，网络结构重建并在体温下得以保持，确保装载药剂的保留。
3.3. 从准互穿OPO网络中溶解和释放
为评估递送应用的功效，监测了OPO网络的溶解以及装载剂从OPO网络释放随时间的变化。OPO材料可以通过舀取和铺展到表面，或通过注射来沉积。在本体溶液中，OPO粘附在塑料、玻璃和离体视网膜组织上，即使在轻微搅动下也是如此。
如前所述，OPO网络由动态的疏水相互作用维系。在本体溶液中，网络吸收水分并溶胀。同时，OPO聚合物链从网络中脱离并溶解到本体溶液中。在临界数量的聚合物链溶解后，网络结构坍塌。
OPO网络在本体溶液中保持视觉完整40–50分钟。通过监测本体溶液中OPO聚合物链的浓度随时间变化来量化OPO网络的溶解。这些测量结果与定性观察基本一致。在40分钟内，从网络中流失到本体溶液中的OPO聚合物质量逐渐增加。40分钟后，溶解的OPO质量达到平台期，与网络的视觉溶解相对应。
选择分子量为2 MDa的异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料作为模型，以监测装载剂从OPO网络中释放。在此分子量下，异硫氰酸荧光素-葡聚糖的流体动力学半径与腺相关病毒载体相当，从而模拟了常用于介导视网膜基因疗法的病毒的扩散。此外，异硫氰酸荧光素-葡聚糖可通过荧光测量轻松检测。通过将OPO重悬于染料溶液中，将异硫氰酸荧光素-葡聚糖装载到OPO网络中。将装载的OPO注射到小瓶中，在磷酸盐缓冲盐水中孵育，并评估染料从OPO网络释放到本体溶液中随时间的变化。
大多数异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料在注射到小瓶后保留在OPO材料中。随后，异硫氰酸荧光素-葡聚糖从OPO网络中释放约60分钟。60分钟后，释放达到平台期。这与测得的OPO网络溶解相似，表明OPO的溶解是驱动装载剂释放的重要因素。
进一步比较了溶解速率和释放速率。通过将每个时间点测得的质量除以孵育24小时后测得的质量，确定了溶解的OPO质量百分比和释放的异硫氰酸荧光素-葡聚糖质量百分比。线性关系强化了理解，即OPO网络的溶解驱动装载剂的释放。随着OPO链溶解，材料变得更加流体化，装载剂从液相中逐渐洗脱到周围环境中。
由于OPO的溶解驱动装载剂的释放，温度和搅动可能影响从OPO材料的释放曲线。例如，升高温度和增加搅动通常会提高溶解速率，从而可能增加从OPO材料的释放速率。为了更好地理解OPO材料在体内的行为，监测了在37 °C下有/无摇床搅动时异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料的释放。与在室温下搅动的样品相比，在37 °C下搅动的样品释放装载剂更快。当样品不搅动时，初始释放速率降低了约6.5倍。在两种情况下，OPO材料在注射后保留了超过90%的装载货物，并保持视觉完整超过30分钟。体内眼内温度通常低于37 °C，并且虽然在视网膜表面的搅动难以量化，但预期会低于在250 rpm运行的摇床引起的搅动。因此，预期体内释放曲线将介于所展示的曲线之间。
这些结果表明，OPO非常适合递送腺相关病毒载体。网络保持完整超过30分钟，便于沉积到视网膜表面。该材料易于通过注射沉积，注射时保留装载剂，并且即使在搅动下也保持粘附性。随着时间的推移，网络溶解，将装载剂释放到周围环境中。
3.4. OPO背衬层
随着OPO网络溶解，装载剂向所有方向径向扩散。假设通过在装载递送剂的OPO后面放置一个未装载的OPO材料背衬层，可以增强对释放方向的控制。
为评估这一假设，开发了一个两室样品架。一个圆形样品池在中心连接两个腔室。将装载异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料的OPO沉积在样品池的一个窗口上，同时将未装载药剂的OPO沉积在相对的窗口上，使两层接触。对于对照测量，将装载异硫氰酸荧光素-葡聚糖染料的OPO沉积在每个窗口上。每个腔室充满磷酸盐缓冲盐水，磷酸盐缓冲盐水可以通过包含OPO的样品池在腔室之间通过。通过从每个腔室取样随时间测量异硫氰酸荧光素-葡聚糖荧光来评估释放。
在早期时间点，染料释放到任一腔室中均可忽略不计。150分钟后，染料开始扩散到腔室中。当包含背衬层时，染料优先扩散到背衬层对面的腔室，并且每个腔室之间的染料质量差异较大。相反，当没有背衬层时，染料扩散到两个腔室，腔室之间的质量差异较小。
在染料初始释放后，观察到染料释放的平均相对质量存在较大的标准偏差，表明测量存在变异性。假设这种变异性是系统平衡的结果。在240分钟时，标准偏差减小。此时，当包含背衬层时，测量到任一腔室中染料的相对质量存在统计学差异。当不包含背衬层时，未测量到腔室之间的统计学差异。这种差异进一步反映在照片中。当包含背衬层时，240分钟后，背衬层对面的腔室明显更黄，表明存在更多染料。当不包含背衬层时，两个腔室都呈黄色。几小时后，无论是否包含背衬层，两个腔室都呈黄色。这与材料的溶解相对应，并证实缓冲液和染料能够在腔室之间流动。
应该注意的是，这些测量结果与前面报告的释放实验的结果并不完全一致。除了更长的平衡期外，OPO网络在背衬层实验期间保持完整的时间更长。将这些差异归因于实验设置的差异。在前面，装载的OPO在本体缓冲液中孵育。相比之下，此处OPO沉积在样品池中，只有其部分表面暴露于本体磷酸盐缓冲盐水。此外，未装载的OPO背衬层部分阻挡了装载层暴露于本体磷酸盐缓冲盐水。这种暴露于本体溶液的减少可以解释达到平衡所需的额外时间，以及OPO网络寿命的延长。这些结果进一步表明，在实践中，未装载的材料背衬层可以延长从OPO材料释放装载剂的持续时间。
这些结果表明，在装载的OPO层后面放置未装载的OPO背衬层可促进单向扩散远离背衬层。在实践中，可以将背衬层放置在装载层之上，以增强装载剂向视网膜的释放。这将实现更局部的释放，减少有效治疗所需的治疗剂用量。
3.5. AAV在OPO网络中的稳定性和分布
腺相关病毒已被认为是将基因转导至视网膜细胞、介导视网膜基因疗法的有前途的候选者。为进一步证明使用OPO递送视网膜基因疗法的可行性，制备了装载AAV的OPO，并研究了装载AAV的OPO的特性。
如2.3.1节所述制备装载AAV的OPO。简要步骤是，在注射器中用AAV溶液将OPO稀释至14%浓度。然后将混合物离心，直至OPO重悬成透明材料。制备了病毒滴度约为1010GC/mL的OPO材料。在此滴度下，OPO材料等分试样中有足够量的AAV，可使用定量聚合酶链反应滴度试剂盒测量AAV的稳定性和分布。为了便于样品间比较，将测得的滴度归一化为最初用于重悬OPO样品的AAV溶液的滴度。
显示了OPO中随时间变化的AAV滴度测量结果。首先在制备装载AAV的OPO后立即测量AAV滴度。随后，在24、48和144小时后测量滴度。在测量之间，装载AAV的
