《Journal of the National Cancer Center》：Irreversible electroporation activates the NLRP3 inflammasome pathway mediating the antitumor immune responses in pancreatic cancer
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为解决胰腺癌现有疗法局限（如放疗化疗不敏感、热消融损伤大），研究人员探索了不可逆电穿孔(IRE)这一非热消融技术如何通过激活NLRP3炎性小体通路，诱导损伤相关分子模式(DAMPs)释放，从而重塑肿瘤微环境，将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，并激发局部及全身性抗肿瘤免疫反应，为胰腺癌免疫联合治疗提供新策略。
胰腺癌素以其“癌中之王”的恶名令人闻之色变，不仅发病率在全球恶性肿瘤中占比高达3%，其死亡率更是令人咋舌，在男性和女性中分别达到了11%和8%。更严峻的现实是，大多数患者在确诊后六个月内不幸离世，五年生存率仅徘徊在12%左右。这种困境背后，是当前治疗手段的局限性：手术切除和热消融可能对周围组织造成严重损伤，而胰腺癌本身对放化疗又常常表现出令人沮丧的“冷漠”（不敏感）。在精准医疗和免疫治疗方兴未艾的今天，胰腺癌的肿瘤微环境却往往呈现出一种“免疫荒漠”状态，缺乏足够的免疫细胞浸润，使得免疫疗法难以施展拳脚。因此，探索一种能够直接杀伤肿瘤、同时又能有效激活患者自身免疫系统的“双重打击”策略，成为临床上的迫切需求。
就在这样的背景下，一项由Nana Zhang、Zhixuan Zhang、Xi Zhang、Zhuoqun Li、Wei Zhang、Minge Wu、Shenao Qu、Haoyang Zhu、Dinghui Dong、Tong Yang、Xiaoli Liu、Zhijun Liu和Yi Lyu共同完成的研究，将目光投向了不可逆电穿孔这种新兴的物理消融技术。它凭借“非热”的特性避免了热损伤，同时其潜在的免疫激活效应引起了研究者的浓厚兴趣。然而，IRE引发的免疫反应究竟具有怎样的特征和内在机制，此前却如雾里看花，不甚清晰。为了揭开这层神秘面纱，研究人员在《Journal of the National Cancer Center》上发表论文，系统深入地探讨了IRE如何通过激活NLRP3炎性小体通路，从而介导强大的抗肿瘤免疫反应。
为了回答上述核心问题，研究者们综合运用了多种关键技术。首先，他们构建了小鼠原位胰腺癌模型以及双侧皮下肿瘤模型，以模拟局部和全身的免疫效应。在方法学上，流式细胞术和多重免疫荧光染色技术被用来精准检测肿瘤组织中各种免疫细胞亚型的动态变化，例如细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞等。同时，通过建立体外效应细胞-靶细胞共培养模型，评估了IRE处理后的脾细胞对肿瘤细胞的直接杀伤能力。在机制探索层面，研究采用了酶联免疫吸附试验检测损伤相关分子模式（如ATP、HMGB1）和促炎细胞因子（IL-1β、IL-18）的释放；利用蛋白质印迹和定量实时聚合酶链式反应分析了NLRP3炎性小体通路关键蛋白（如NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1、GSDMD）的表达；并通过免疫荧光观察了ASC speck（凋亡相关斑点样蛋白聚集体）的形成，以证实炎性小体的激活。此外，还使用了特异性抑制剂双硫仑（DSF）进行干预实验，以确认NLRP3通路在IRE免疫激活中的因果关系。
IRE消融后72小时，原位胰腺癌中T淋巴细胞浸润达到峰值
组织学检查显示，IRE处理24小时后，肿瘤组织开始坏死并伴有少量免疫细胞浸润。随着时间推移，坏死区域逐渐扩大，至第5天时肿瘤坏死已较为彻底。值得注意的是，免疫细胞在肿瘤组织中的浸润在IRE治疗后72小时达到顶峰。流式细胞术分析进一步证实，此时肿瘤组织中白细胞和T淋巴细胞的比例在所有观察时间点中是最高的。
IRE系统性地诱导免疫细胞向抗肿瘤免疫表型极化
在全身水平，IRE处理显著改变了脾脏和外周血中的免疫细胞构成。在脾细胞中，具有抗肿瘤表型的M1型肿瘤相关巨噬细胞比例显著升高。在外周血中，T细胞、细胞毒性T细胞、分泌干扰素-γ的辅助性T细胞和细胞毒性T细胞亚群比例均显著增加。相反，在假手术组中占主导地位的B细胞和辅助性T细胞比例在IRE组中则显著降低。这些变化表明，IRE能够系统性地将免疫平衡推向有利于抗肿瘤的方向。
IRE在局部癌组织中诱导免疫细胞向抗肿瘤免疫表型极化
在肿瘤局部微环境中，多重免疫荧光分析显示，IRE治疗后肿瘤内细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、M1型肿瘤相关巨噬细胞以及分泌颗粒酶B的细胞毒性T淋巴细胞密度均显著增加，而具有免疫抑制作用的M2型肿瘤相关巨噬细胞则减少。流式细胞术得到了相似的结果，并且抗肿瘤表型的细胞毒性T细胞、Tc1细胞和M1型巨噬细胞亚型在比例上显著超过了其对应的免疫抑制表型亚型。
IRE诱导的免疫反应在体内外均具有杀伤肿瘤的效果
研究人员建立了双侧皮下肿瘤模型，在一侧肿瘤进行IRE消融后，立即在对侧接种新的胰腺癌细胞。结果发现，IRE处理不仅抑制了被消融侧肿瘤的生长，同时也显著延缓了对侧新接种肿瘤的形成，其体积和重量均显著小于假手术组。对侧肿瘤组织的分析显示，其中CD3+T细胞、CD8+T细胞和自然杀伤细胞密度更高。体外实验也证实，从IRE处理小鼠分离的脾细胞对胰腺癌细胞的杀伤能力显著增强。
IRE诱导免疫反应的抗肿瘤特异性
为了检验免疫反应的特异性，研究者在IRE处理胰腺癌小鼠后，用异源性的结肠癌细胞或黑色素瘤细胞进行二次攻击。尽管这两种异源肿瘤最终都形成了，但其生长速度和肿瘤质量均被显著抑制。体外杀伤实验显示，IRE预处理的脾细胞对胰腺癌、结肠癌和黑色素瘤细胞均具有增强的杀伤作用，但对同源的胰腺癌细胞杀伤效力最高，表明IRE诱导的免疫兼具一定的肿瘤特异性基础和广谱的抗肿瘤活性。
IRE诱导癌细胞释放危险相关分子模式
机制探索始于IRE对细胞膜的物理破坏。研究证实，IRE处理后，胰腺癌细胞的活性氧水平显著升高。同时，关键的DAMPs分子——三磷酸腺苷和高迁移率族蛋白B1在细胞上清和小鼠肿瘤组织匀浆中的水平也显著增加。免疫组化分析进一步发现，HMGB1的经典受体Toll样受体4在IRE处理后表达上调，验证了HMGB1-TLR4轴的激活。
IRE诱导NLRP3炎性小体通路激活
DAMPs和活性氧是激活NLRP3炎性小体的主要刺激物。研究结果显示，IRE处理后，肿瘤组织中NLRP3、ASC、IL-1β和IL-18的mRNA表达上调。在蛋白水平，吡啶凋亡（一种程序性细胞死亡）的关键分子如ASC、cleaved-caspase-1和N端GSDMD在IRE组表达显著更高。外周血和癌组织中的促炎因子IL-1β和IL-18水平也显著升高。体外细胞实验同样证实，IRE能激活胰腺癌细胞中的NLRP3炎性小体通路，并观察到ASC蛋白聚集形成 speck 结构。
双硫仑（DSF）减弱IRE诱导的NLRP3炎性小体激活
为了确立因果关系，研究使用了特异性NLRP3抑制剂双硫仑进行干预。在IRE处理前用双硫仑预处理胰腺癌细胞，能显著抑制IRE引起的caspase-1切割、N端GSDMD激活以及IL-1β和IL-18的成熟。免疫荧光也证实双硫仑抑制了IRE触发的ASC speck形成。这直接证明IRE诱导的炎性小体激活是特异性的，并且依赖于NLRP3。
这项研究揭示，IRE对胰腺癌的疗效远不止直接的物理消融。它通过破坏肿瘤细胞膜，释放DAMPs如ATP和HMGB1，并产生活性氧，从而激活了先天性免疫的关键传感器——NLRP3炎性小体。活化的炎性小体进一步促使caspase-1切割GSDMD蛋白，引发吡啶凋亡，并大量释放IL-1β和IL-18等强效促炎细胞因子。这一系列的“危险信号”和炎症风暴，成功地重塑了肿瘤免疫微环境，将原本“冷漠”的胰腺癌转变为“火热”的炎症状态。具体表现为：系统性和局部性的免疫细胞（尤其是T细胞和巨噬细胞）向抗肿瘤表型极化并大量浸润；诱导产生了具有直接杀伤肿瘤细胞能力的免疫效应；甚至对异种肿瘤也展现出一定的抑制效果。尽管这种免疫反应缺乏严格的肿瘤特异性，但其在激活全身性抗肿瘤免疫的同时，相关不良反应发生率较低，显示了良好的治疗窗口。
本研究的结论强调了IRE作为一种局部消融技术，兼具强大的系统性免疫调节功能。其通过激活NLRP3炎性小体通路，释放促炎因子，是实现从“冷肿瘤”到“热肿瘤”转变的核心机制。这为临床上将IRE与免疫检查点抑制剂等免疫疗法联合使用，以治疗胰腺癌等难治性肿瘤，提供了坚实的理论依据和崭新的视角。将一种物理消融手段转化为潜在的免疫调节疗法，不仅拓展了IRE的应用边界，也为肿瘤综合治疗模式的创新带来了重要启示。
