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本研究发现，位于糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定生物合成途径关键基因PIGM的编码区双等位基因变异（c.1001A>C, p.Gln334Pro）可导致严重的早发性发育性癫痫性脑病（DEE）。研究通过两例不相关患儿的临床、遗传与功能学分析，证实了PIGM是该类脑病的致病基因，并首次将髓鞘形成不良和产前发病纳入其疾病谱。研究结果强调了在DEE和脑白质病变鉴别诊断中包含PIGM的必要性，并为理解GPI锚定缺陷病的表型异质性提供了新见解。
PIGM编码区致病性变异与严重发育性癫痫性脑病
1 引言
糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白（GPI-APs）是一类通过GPI锚定在细胞膜表面的蛋白质，其合成涉及超过30个基因。PIGM基因编码GPI锚合成途径中甘露糖基转移的关键酶。既往报道的PIGM致病变异主要集中在启动子区（c.-270C>G），与相对较轻的临床表型相关，主要表现为门静脉血栓形成和失神发作。而近期证据表明，编码区变异可导致一种更为严重的多系统疾病。本研究旨在报告两例携带相同编码区纯合错义变异的患儿，以扩大对PIGM缺陷病临床、基因型和影像学谱系的认识。
2 材料与方法
研究包括遗传学分析、患者招募、功能学检测和结构模型分析。对一例早发性DEE患儿进行全外显子组测序重分析，并通过数据比对发现另一例表型相似的患儿。通过流式细胞术评估GPI锚缺陷，使用针对CD16、CD55、CD24的抗体检测粒细胞表面GPI-AP的表达。在HEK293 PIGM敲除细胞系中，通过瞬时转染野生型和突变型PIGM载体，并在强/弱启动子驱动下，评估其恢复GPI-AP（DAF、CD59、FLAER）表达的能力。利用AlphaFold预测的蛋白结构模型对已报道的PIGM变异进行定位分析。此外，回顾了迄今为止所有报道的PIGM变异病例。
3 结果
3.1 病例1
患儿为11月龄男婴，父母为近亲婚配。孕31周出现一过性羊水过多。出生后出现轻度缺氧缺血性脑病（HIE）征象。患儿表现为严重的发育性脑病和多系统疾病。癫痫发作始于3月龄，表现为局灶性强直和/或阵挛发作及紫绀事件。神经系统评估显示进行性小头畸形、严重的全面性发育迟缓，包括无头控、极少的社交互动，以及无目的性的视觉或运动反应。此外，还存在运动过度障碍、易怒、睡眠觉醒周期紊乱、严重感音神经性听力损失、视觉障碍、肝肿大和皮肤色素沉着障碍。
癫痫呈难治性，尽管使用了多种抗癫痫药物（包括丙戊酸、左乙拉西坦、拉科酰胺、奥卡西平、卢非酰胺、吡哆醇、吡仑帕奈、托吡酯、布立西坦和生酮饮食），仍每日发作，常需咪达唑仑急救。自8月龄起，患儿反复发生超级难治性癫痫持续状态，多次入住PICU，接受了持续氯胺酮输注和大剂量类固醇治疗，病情仅得到短暂改善。
脑电图（EEG）最初显示多灶性和双侧性癫痫样放电伴弥漫性背景活动减慢。从8月龄起，所有EEG均显示双侧重叠的局灶性癫痫发作，在左右半球之间交替，占记录时间50%以上，符合癫痫持续状态。
11月龄时的脑MRI显示弥漫性幕上髓鞘形成不良，额颞部蛛网膜下腔增宽，左侧海马硬化征象，以及双侧脑桥中央被盖束受累。
广泛的代谢检查结果正常。后续基因分析检测到PIGM致病性变异，并尝试了苯丁酸钠治疗，但在疾病晚期未观察到对癫痫发作的积极效果。鉴于疾病进展、严重程度、预后不良且缺乏有效治疗，启动了多学科儿童姑息治疗。患儿在11月龄时因进行性神经功能恶化和难治性癫痫持续状态去世。
3.2 病例2
患儿为4岁男童，父母近亲婚配。妊娠期胎动减少。出生后有短暂紫绀。早期临床征象提示严重脑病。精神运动发育严重迟缓，2岁获得头控，3岁可独坐，不能行走。无语言和理解能力，存在异常的视觉行为，缺乏社交互动。
癫痫发作始于3月龄，为全面性阵挛发作，初期对地西泮和苯巴比妥反应良好，后发展为反复的局灶性和全面性发作，经历多种抗癫痫药（丙戊酸钠、氯硝西泮、左乙拉西坦）调整，未能有效控制。临床病程进展为难治性癫痫，表现为癫痫性痉挛、肌阵挛发作和反复的Todd麻痹。
神经系统检查显示进行性小头畸形（-3 SD）、面部畸形（左眼外斜视、水平眼球震颤）、肝肿大、社交互动差、无视觉追踪、严重中轴肌张力低下、痉挛性四肢瘫伴肢体关节挛缩。
系列EEG显示严重异常活动，包括多灶性癫痫样放电和高度节律失调。10月龄时脑MRI显示进行性皮质和皮质下萎缩，左半球更明显，FLAIR和T2序列可见皮质下白质高信号。磁共振波谱正常。眼底镜检查显示视神经萎缩。腹部超声显示均匀性肝肿大，门静脉和肝上静脉通畅。代谢检查无异常。
疾病以严重的发育障碍、药物难治性癫痫和多系统受累为特征，呈进行性病程，患儿于4岁时死亡。
3.2.1 遗传学数据
病例1的初步遗传学检测（全外显子组测序、芯片、核型、线粒体DNA测序）未发现明确致病性变异。后续重分析发现了PIGM基因的纯合错义变异（NM_145167.3, c.1001A>C, p.Gln334Pro）。Sanger测序验证，分离分析显示父母均为携带者。该变异在gnomAD v4.1.0数据库中等位基因频率极低（约0.0000037），对照组中无纯合个体报道。多种计算机致病性预测工具（PolyPhen-2得分1.00，CADD得分29.4，REVEL得分0.65）提示其具有潜在有害效应。目前该变异在ClinVar中被归类为意义不明确变异（VOUS）。
病例2通过全外显子组测序也鉴定出相同的PIGM纯合错义变异，Sanger测序证实父母均为杂合携带者。
根据ACMG指南，结合上述信息、下述功能学研究观察到的效应，以及发现两例不同患者携带相同变异且具有相似表型，变异c.1001A>C, p.Gln334Pro可被认为是“可能致病性”（PS3中等，PS4支持，PM2，PM3，PP3）。
蛋白结构分析显示，将已报道的6个编码区变异映射到PIGM蛋白三维结构上，发现c.224G>A p.Arg75His位于腔域，不形成特定结构特征；c.402C>A, p.Asn134Lys位于胞质域，连接两个连续的α螺旋；移码变异c.1254_1257del (p.Arg419Serfs81)也位于胞质域，影响蛋白C端区域；c.1111T>C; p.Trp371Arg、c.959A>G; p.His320Arg和c.1001A>C; p.Gln334Pro则位于跨膜螺旋内。A (p.Arg75His), homozygous in patients 8–10; yellow, c.1254_1257del (p.Arg419Serfs*81), found in compound heterozygosity with red, c.1111T>C (p.Trp371Arg), in patient 12, and with orange, c.402C>A (p.Asn134Lys), in patient 13; violet, c.959A>G (p.His320Arg), homozygous in patient 11; green, c.1001A>C (p.Gln334Pro), homozygous in patients 14 and 15 (present study).">
3.2.2 流式细胞术
病例1的粒细胞流式细胞术分析显示GPI锚定蛋白部分缺陷。与对照样本相比，患者样本的CD24和CD16平均荧光强度（MFI）值显著降低，表明这些蛋白的GPI锚定受损。而CD55表达保留，荧光强度水平与对照相似。CD16和CD24的荧光强度直方图明显左移。这表明存在选择性缺陷，而非GPI锚生物合成的全面受损，反映了不同GPI-AP对锚定可用性或结构质量的不同敏感性。
3.2.3 功能学分析
在强启动子驱动下，将野生型和突变型PIGM转染至HEK293 PIGM敲除细胞，突变蛋白表达正常，并能将GPI-AP（DAF和CD59）的细胞表面表达恢复至与野生型相同的水平。然而，在弱启动子驱动下，突变型PIGM未能将GPI-AP表达恢复至野生型水平，提示p.Gln334Pro突变蛋白的活性受损。
4 讨论
本研究描述了两例携带相同PIGM纯合变异（c.1001A>C; p.Gln334Pro）的新患者，表现为早发性严重发育性癫痫性脑病、多系统疾病及显著的MRI髓鞘形成不良。
据我们所知，这是关于编码区遗传变异导致常染色体隐性遗传PIGM缺陷的第四篇报告。已发现两种类型的双等位基因致病变异：启动子突变（c.-270C>G）和编码区突变。启动子突变通常与门静脉血栓形成、难治性失神发作等相对局限的表型相关。而编码区突变患者则表现出更严重的多系统疾病，包括早发性癫痫、全面性发育迟缓和多器官受累。这种双突变机制导致的表型谱差异，目前仅在GPI锚生物合成途径的另一个基因PIGY中有过报道。
本研究的两位患者表现出严重、早发的神经及多系统疾病。神经学特征包括婴儿早期开始的难治性癫痫、严重的全面性神经发育迟缓。临床表现为肌张力低下性四肢瘫，其中一例还伴有舞蹈样运动过度障碍。两人均有肝肿大但无门脉高压征象。其他特征还包括非鱼鳞病样皮肤色素沉着障碍、视觉障碍、严重先天性感音神经性听力损失和进行性吞咽困难。两人均因无法控制的癫痫脑病及疾病进展而过早死亡。
4.1 神经影像学与PIGM患者的髓鞘形成不良
PIGM突变患者的神经影像学表现多样。早期启动子变异病例的脑MRI正常，后续报道描述了进行性幕上和幕下萎缩以及弥漫性血栓缺血性病变。编码区变异患者的影像学数据有限，但脑萎缩是一个一致的特征。更严重的异常也有报道，如多囊性脑软化和硬膜下血肿。值得注意的是，本研究的病例1表现出髓鞘形成不良，这是此前未与PIGM缺陷关联的特征，但在一些GPI锚生物合成缺陷病（GPI病）中有过描述。观察到的髓鞘形成不良机制可能与Wolf等人提出的“继发性髓鞘形成不良”概念一致，即早期神经元功能障碍扰乱了轴突-胶质细胞信号传导，继而阻碍髓鞘形成。类似的级联反应见于SPTAN1、HSPD1和UFM1脑病。在部分PIGA相关脑病患者中也记录到髓鞘形成不良。尽管髓鞘形成不良并非在所有GPI病中都普遍存在，但其在PIGA和PIGM缺陷中的出现，提示了共同的潜在下游机制。
此外，本研究的两个病例均观察到继发于脑萎缩的进行性小头畸形（-3 SD），这是以前在PIGM相关疾病中未描述的非典型发现。相反，文献报道的四名患者（三名携带启动子变异c.-270，一名携带c.959A>G; p.(His320Arg)变异）尽管伴有脑萎缩、获得性血栓性脑并发症或多囊性脑软化，但仍表现为静止性或进行性巨头畸形。
与先前报道的PIG病患者观察结果相似，病例1的粒细胞流式细胞术分析显示CD16和CD24表达降低，CD55水平正常。这些发现提示部分GPI锚缺陷。除了三名携带c.224G>A (p.Arg75His)变异、表型较轻的患者外，大多数已报道的携带PIGM双等位基因突变的患者都表现出异常的流式细胞术结果。但由于病例数少、使用组织不同（粒细胞、成纤维细胞）以及分析的标志物（如CD16、CD24、CD55、CD59）存在差异，难以得出更明确的结论。这些发现与其他PIG病有重叠。尽管不是特异性标志物，但流式细胞术异常可能作为PIG病诊断评估中有用的生物标志物。
在治疗方面，病例1根据Almeida等人发表的方案接受了苯丁酸钠治疗，但无效。需要指出的是，治疗试验是在疾病终末期开始的，当时患者处于超级难治性癫痫持续状态，几天后即因疾病晚期进展而去世。迄今为止，尚无其他编码区突变患者接受苯丁酸钠治疗试验的报道。使用苯丁酸钠的原理在于其作为组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，旨在增强PIGM转录。在启动子区突变病例中，SP1结合位点被破坏，导致转录激活受损，组蛋白乙酰化降低进而导致基因表达下降。HDAC抑制可增加组蛋白乙酰化，部分恢复PIGM表达。然而，这种治疗机制不适用于编码区突变病例，因为后者的致病效应源于蛋白质结构改变，而非转录失调。根据这一假设，更早给予苯丁酸钠治疗也不太可能改善本研究中编码区突变患儿的临床病程。
4.2 表型-基因型关联
本研究的比较分析旨在阐明潜在的基因型-表型关联。研究结果表明，变异在蛋白质结构域中的位置及其预测的结构后果，可能是观察到的临床严重程度变异性的基础。
来自同一家族、携带纯合p.(Arg75His)错义变异的三名患者表现出相对较轻的表型。该变异位于蛋白质的腔区，在当前三维模型中未映射到任何明确的二级结构元件。推测该替换影响了蛋白质功能，但并未严重破坏蛋白质的折叠或膜锚定，从而保留了部分残余活性。
相比之下，携带其他变异的五名患者表现出更严重的临床表现。其中两名患者为预测会影响跨膜螺旋的错义变异纯合子（p.His320Arg和p.Gln334Pro）。这些螺旋结构域的破坏可能对蛋白质的整体构象产生实质性影响，可能损害其在膜内的正确插入或稳定性。这一假设得到了两名复合杂合变异患者的进一步支持：其中一例是截短移码突变（p.Arg419Serfs81）与跨膜螺旋错义变异（p.Trp371Arg）的组合；另一例是位于胞质域的错义变异（p.Asn134Lys）。有趣的是，尽管p.(Asn134Lys)在文献中被注释为位于胞质域，但3D结构数据表明它有助于连接两个连续的α螺旋，提示该替换可能破坏局部折叠或损害对PIGM转移酶活性至关重要的相互作用。另一方面，移码变异p.(Arg419Serfs81)预计会通过引入异常的C端延伸来延长蛋白质。这种修饰可能会干扰正常的翻译终止或改变蛋白质的折叠环境，进一步损害功能。
综上所述，这些观察结果支持以下观点：可能影响跨膜螺旋形成或引入移码延伸的突变与更严重的表型相关，这可能是由于它们对蛋白质构象和膜定位的显著影响。相反，位于明确结构元件之外的错义变异，如p.(Arg75His)，可能部分保留了蛋白质功能，导致较轻的临床表现。这种基因型-表型关联强调了在解释致病性和预测疾病严重程度时，考虑PIGM突变的位置背景和结构后果的重要性。
5 结论
本报告通过描述两例携带编码区纯合变异（c.1001A>C; p.Gln334Pro）的不相关患者，扩大了PIGM相关疾病的表型和基因型谱系，该变异与早发性发育性癫痫性脑病、多系统受累和髓鞘形成不良相关。这些发现确立了DEE作为PIGM编码区突变所致缺陷的一个突出且先前未被充分认识的临床标志，使其与其他严重的GPI锚生物合成缺陷病一致。此外，髓鞘形成不良的存在表明，在伴有早发性癫痫的遗传性脑白质病的鉴别诊断中应考虑PIGM。致病变异的结构分析支持基因型-表型关联，即影响跨膜结构域或引入移码延伸的突变与更严重的疾病相关。最后，本研究数据强调了在这种破坏性疾病中进行早期基因诊断、全面神经影像学随访以及进一步探索靶向治疗的必要性。
