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本研究采用孟德尔随机化（MR）及多元MR、中介分析等多种方法，深入探讨了心血管疾病（CVD）相关血浆蛋白与帕金森病（PD）之间的潜在因果关系，并首次揭示了四种特定免疫表型在其中发挥的关键中介作用。研究发现Fas细胞表面死亡受体（Fas）和神经生长因子（NGF）是PD的保护因素，而血栓调节蛋白（TM）是风险因素，相关通路涉及神经炎症、血脑屏障（BBB）等，为PD的机制研究与靶点发现提供了新见解。
1. 引言
帕金森病（PD）是第二大常见的神经退行性疾病，以黑质多巴胺能神经元丢失和α-突触核蛋白聚集为特征，并伴有震颤、运动迟缓和强直等典型运动症状。全球范围内，随着老年人口的增长，PD的疾病负担在过去数十年间翻了一倍以上。与此同时，心血管疾病（CVDs）是主要的与年龄相关的疾病，是造成非传染性疾病负担的重要因素之一。既往研究报道，卒中、冠状动脉疾病等心血管事件可能是PD发病机制的潜在组成部分，而近期研究进一步证明了PD与CVD及卒中风险增加之间的因果关系，提示这两种疾病间存在显著关联。这暗示PD不仅可能与心血管问题共存，还可能主动促进其发展。
2017年，Folkersen等人提出了83种与CVD相关的血浆蛋白，认为它们有潜力作为预测心血管风险的生物标志物。而在PD与血浆蛋白的关系方面，近期一项基于英国生物银行数据的分析识别出了一组可显著改善PD发病预测的22种血浆蛋白，表明其在高危人群早期识别中的潜在应用价值。血浆蛋白作为生物标志物前景广阔，有望助力早期诊断并指导治疗策略。
神经炎症是PD病理生理学的核心参与者，小胶质细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等多种免疫细胞通过释放炎症介质及相互作用参与其中，最终直接或间接导致神经元死亡，显著影响PD进展。心血管系统同样包含多种免疫细胞，如巨噬细胞、T细胞和B细胞，它们参与维持稳态并影响病理过程。大量研究已明确证实这些免疫细胞与CVD的发生及预后存在深刻的因果关系，平衡这些免疫反应至关重要。
基于以上证据，本研究提出假设：CVD相关蛋白与PD之间存在显著的因果关系，而特定的免疫细胞表型在其中起到关键的中介作用。本研究旨在综合利用公开遗传数据，深入探讨心脑血管疾病相关蛋白与PD风险之间的潜在因果关系，并探究免疫细胞表型的中介角色。
2. 材料与方法
本研究采用孟德尔随机化（MR）设计。MR是一种利用遗传变异作为自然实验，以提供可改变的风险因素与疾病之间假定因果关系的证据的研究方法，可最大程度减少流行病学研究中的混杂偏倚和反向因果关系。本研究遵循STROBE-MR（利用MR加强流行病学观察性研究报告）指南。
研究利用了已发表的全基因组关联研究（GWAS）的汇总数据，包括731种免疫细胞表型和83种CVD相关蛋白，并选取合适的单核苷酸多态性（SNPs）作为工具变量（IVs）进行MR分析，以探究它们之间的双向因果关系。工具变量的应用需满足三个关键假设：(i) 所选的IVs与感兴趣的暴露因素有强关联；(ii) IVs不受除暴露外影响结局的因素混杂；(iii) 所选的IVs仅通过暴露影响结局。
免疫细胞数据来源于Orrù等人进行的GWAS研究，涉及来自撒丁岛的3757名个体。该研究涵盖了731种免疫表型，包括118种绝对细胞计数（ACs）、389种反映表面抗原水平的中位荧光强度（MFIs）、32种形态学参数（MPs）和192种相对细胞计数（RCs）。PD相关遗传数据来源于FinnGen联盟（R10版本），样本包含412,181名欧洲血统个体。CVD相关血浆蛋白数据来自Folkersen等人2017年的研究，共涉及3394名至少具有三个已确立CVD风险因素的欧洲受试者。
为确保MR分析的稳健性和可靠性，本研究对IVs的筛选设定了严格标准：与暴露关联的显著性水平设为1×10-5；去除SNPs间的连锁不平衡（LD）（r2< 0.001，聚集距离=10,000 kb）；剔除弱工具变量（F > 10）；最后协调暴露与结局的SNPs效应等位基因方向，并排除回文SNPs或等位基因频率不兼容的SNPs。
统计分析主要采用逆方差加权（IVW）法评估暴露与结局的相关性，结果以β值及其标准误（SEs）或比值比（ORs）及其95%置信区间（CIs）呈现。通过Cochrane's Q检验评估异质性，通过MR-Egger回归截距和MR多效性残差和与离群值（MR-PRESSO）评估潜在的水平多效性。采用留一法进行敏感性分析。对于先前MR分析中p < 0.10的结局，使用MR-Egger法、加权中位数法和简单中位数法等其他模型进行验证。对MR分析提示存在因果关系的CVD相关血浆蛋白和PD，进一步进行了反向MR分析以推断双向因果关系。
对于在暴露或结局GWAS数据中达到α = 1×10-5显著性水平的位点，提取其所在基因座位信息作为目标基因，使用KOBAS工具对目标基因进行GO和KEGG富集分析，并利用String平台进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建。所有统计分析均使用R 4.3.2版本完成。
3. 结果
3.1. CVD相关血浆蛋白与PD的双向因果效应
通过双向两样本MR分析，本研究识别出三种与PD相关的CVD相关血浆蛋白。IVW模型结果显示，Fas细胞表面死亡受体（OR = 0.929，95%CI：0.876-0.986，p = 0.015）与PD风险增加呈负相关。调整血栓调节蛋白后，Fas与PD间的因果关系依然存在（OR = 0.940，95%CI：0.917-0.963，p < 0.001）。神经生长因子（OR = 0.983，95%CI：0.968-0.998，p = 0.026）也与PD风险增加呈负相关。调整血栓调节蛋白（OR = 0.923，95%CI：0.878-0.988，p = 0.010）或同时调整Fas和血栓调节蛋白（OR = 0.933，95%CI：0.898-0.988，p = 0.008）后，神经生长因子与PD的因果关系依然存在。血栓调节蛋白则与PD风险呈正相关（OR = 1.107，95%CI：1.011-1.203，p = 0.028）。调整Fas（OR = 1.109，95%CI：1.075-1.144，p < 0.001）或同时调整Fas和神经生长因子（OR = 1.130，95%CI：1.028-1.241，p = 0.011）后，该因果关系依然显著。所有分析过程中，工具变量间均未发现显著的异质性和水平多效性。在切换至其他MR模型进行敏感性分析时，统计效应在显著性和方向上均未发生明显变化，表明分析结果稳健。在进一步的反向MR分析中，未发现PD的发生对这三种CVD相关蛋白存在反向因果效应。
3.2. CVD相关血浆蛋白与PD的网络效应
从CVD相关阳性血浆蛋白及暴露或结局GWAS数据中（阈值α = 1×10-5）提取SNP位点所在基因区域信息。通过PPI网络分析和KEGG通路富集分析，评估了已识别的CVD相关阳性血浆蛋白与PD之间的网络因果关系。研究发现，这三种CVD相关阳性血浆蛋白与PD相关基因存在复杂的交互网络关系，其中MAPT基因与其他基因的关联度最高。分析还表明，这些血浆蛋白涉及的通路与多发性硬化、抑郁症、Notch通路和视黄醇代谢相关，而这些通路与PD的发生密切相关。这些发现提示CVD相关血浆蛋白与神经精神疾病之间存在紧密联系，并指向了免疫相关通路（如抗原处理和呈递），促使研究者深入探究免疫细胞的潜在中介作用。
3.3. 免疫表型在CVD相关血浆蛋白与PD发病机制关系中的中介效应
研究探索了731种不同免疫表型与PD之间的单变量因果关系。通过中介分析，确定了四种免疫表型在CVD相关血浆蛋白与PD发病机制的关联中发挥显著的中介作用。具体而言，CD28+CD45RA+CD8+T细胞AC具有竞争性中介效应（OR = 1.001，95%CI：0.989-1.013），而CD19在CD24+CD27+B细胞上具有部分中介效应（OR = 0.955，95%CI：0.913-0.998），分别解释了Fas细胞表面死亡受体与PD之间关联的-0.267%和2.898%（中介效应 = 0.0002 和 -0.0021）。
在神经生长因子与PD的关联中，CD27在CD20-B细胞上具有竞争性中介效应（OR = 1.088，95%CI：1.037-1.142），解释了-10.628%的关联（中介效应 = 0.0021）。
此外，HLA DR在CD33-HLA DR+细胞上通过竞争性中介效应介导了血栓调节蛋白与PD之间的关联，解释了-12.691%的关联（中介效应 = -0.0148）。
4. 讨论
基于大量公开的GWAS数据，本研究在遗传水平上探讨了CVD相关血浆蛋白与PD之间的因果关系，并仔细审视了731种免疫细胞表型的中介影响。据我们所知，这是首次通过MR分析探索CVD相关血浆蛋白与PD的因果关系，并探究免疫细胞表型的中介作用。研究结果鉴定出两种与PD呈负因果关系的CVD相关血浆蛋白，并确定了四种免疫细胞表型的重要中介角色。
Fas受体，又称CD95或APO-1，是肿瘤坏死因子受体超家族成员，主要参与介导细胞凋亡，并在免疫系统调节中起关键作用。我们的MR分析结果表明Fas细胞表面死亡受体与PD风险升高呈负相关。已有研究表明，Fas受体的参与可以保护多巴胺能神经元免受神经毒素诱导的损伤，用Fas配体（FasL）处理可显著降低1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）对培养的中脑神经元的毒性，表明Fas信号具有独立于其凋亡功能的保护作用。神经炎症是PD发病机制中的重要分子机制。作为中枢神经系统（CNS）中的主要免疫细胞，小胶质细胞表达Fas，使其能够响应FasL信号。Fas的激活与抑制小胶质细胞活化及减少促炎细胞因子分泌有关，表明Fas信号可能有助于缓解CNS中的过度炎症。鉴于其在介导凋亡和神经保护方面的双重作用，靶向Fas信号通路可能为以炎症和神经元丢失为特征的神经退行性疾病提供治疗机会。
神经生长因子在发育和成年神经生物学中长期扮演关键角色，对周围和中枢神经系统神经细胞的存活、生长和分化发挥至关重要的调节功能。它被认为是治疗阿尔茨海默病（AD）和PD等疾病的有前景的候选疗法，对基底前脑和纹状体的胆碱能神经元具有再生特性。此外，神经生长因子可通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α（PGC-1α）来刺激线粒体活性和生物合成，这一潜在机制在以线粒体功能障碍为关键病理特征的神经退行性疾病中尤为重要。本研究证实了神经生长因子对PD的保护作用。
血脑屏障（BBB）的破坏是包括PD和AD在内的许多神经退行性疾病的标志。此前一项关于AD中BBB功能生物标志物的研究指出，AD患者中可溶性血栓调节蛋白（sTM）抗原和活性水平升高，表明BBB受损。TM可能通过破坏BBB的完整性，在PD的发病机制中发挥负面作用。这些潜在机制与我们MR分析得出的血栓调节蛋白与PD风险呈正相关的发现一致。
通过对三种CVD相关血浆蛋白相关基因的KEGG通路富集分析，可以识别出与这些血浆蛋白相关且与肌萎缩侧索硬化（ALS）、抑郁症、Notch通路和维生素A代谢相关的通路。ALS也是一种常见的神经退行性疾病，海马中存在的Notch通路可影响抑郁的表现和进展，而维生素A可能对神经元产生保护作用，对PD等神经退行性疾病有益。这些发现提示CVD相关血浆蛋白与神经精神疾病之间存在密切联系。此外，在这些通路中识别出的与免疫相关的抗原处理和呈递内容，促使我们深入探究免疫细胞的潜在中介效应。
T细胞和B细胞是机体免疫系统的重要淋巴细胞。我们的中介分析结果表明，CD28+CD45RA+CD8+T细胞AC在Fas细胞表面死亡受体与PD的关系中具有竞争性中介效应，而CD19在CD24+CD27+B细胞上具有部分中介效应。CD28为T细胞活化提供了除T细胞受体（TCR）初级信号外所需的重要第二信号，这对于T细胞的完全活化至关重要，并促进初始T细胞增殖分化为效应细胞。T细胞在PD中作用显著。PD患者CNS中CD8+T细胞的浸润与可能导致神经元损伤的神经炎症过程相关，并可能加剧神经退行性变。同样，T细胞作为CVD中的关键介质，分泌促炎细胞因子促进血管病理。这突显了T细胞在PD等神经退行性疾病和心血管健康中的多方面作用。
CD19是B细胞特异性跨膜糖蛋白，其广泛的胞质结构域设定了内源性B细胞信号阈值，并可能在增强多个受体信号通路的信号转导中起关键作用。产生抗炎细胞因子（如IL-10）的调节性B细胞（Bregs）似乎在PD中具有保护作用，这些细胞比例较高与PD患者较好的运动评分相关，表明它们可能有助于减轻炎症和多巴胺能细胞丢失。另有研究发现，PD患者血清中针对单体α-突触核蛋白的抗体水平高于对照组，这表明B细胞相关的体液免疫在维持稳态和清除蛋白质种类方面具有潜在的保护作用。B细胞越来越被认为是PD发病机制中的重要参与者。它们群体的改变、对α-突触核蛋白的潜在自身免疫反应以及参与神经炎症过程，凸显了其作为病理贡献者和神经退行性变潜在保护者的双重角色。
此外，我们发现CD27在CD20-B细胞上在神经生长因子与PD的关系中具有竞争性中介效应。CD27是一种共刺激分子，当其配体CD70结合时，可增强B细胞活化，促进活化B细胞的存活、增殖和分化。B细胞参与神经炎症的作用显著，先前研究发现，PD患者中产生促炎细胞因子的B淋巴细胞比例增加，这可能促成了PD病理特征性的炎症环境。
HLA-DR是主要组织相容性复合体（MHC）II类分子，通过向CD4+T细胞呈递抗原，在免疫系统中发挥关键作用。HLA-DR在CD33阴性细胞上的表达意味着这些细胞可能参与抗原呈递和T细胞活化。在CVD中，免疫系统的激活对患者预后有负面影响，这进一步支持了免疫在CVD相关血浆蛋白与PD之间的潜在中介作用。
据我们所知，这是首个结合多种生物信息学方法分析免疫细胞在CVD相关血浆蛋白与PD关联中中介作用的研究。本研究基于已发表的大型队列GWAS研究，样本量庞大，统计效力高。多种MR敏感性分析支持了IVW估计的稳健性。我们的中介分析采用了严格的标准，以减轻CVD相关血浆蛋白之间潜在的反向因果关系，并确保所构建模型阐明中介效应的完整性和有效性。
然而，必须承认本研究存在不可否认的局限性。首先，目前关于免疫细胞的大型GWAS研究仅在欧洲人群中进行，这给我们的研究结论带来了种族限制。鉴于不同种族群体的遗传多样性，本研究中确定的免疫细胞中介作用在非欧洲人群中可能表现不同。其次，需要指出的是，MR分析仅基于遗传水平的观察和因果关系推断，无法替代客观领域的临床试验。同时，由于MR研究方法的局限性，忽略了时间在PD过程中的作用，且潜在的混杂因素可能未完全解决。最后，虽然本研究为群体水平的潜在因果关系提供了有力证据，但并未阐明潜在的生物学机制，也缺乏功能研究的验证。未来利用体外和体内模型的研究对于验证这些相互作用并揭示其精确的分子通路至关重要。我们的发现可作为后续研究的关键假设。
我们的研究具有重要的临床应用价值。首先，可以为PD的早期诊断和预防提供新的生物标志物参考，例如TM水平升高等特定标志物的变化可能提示PD的发病和进展。其次，我们的研究强调了PD与CVD之间错综复杂的联系，强调在PD患者的管理和护理中需高度关注心血管疾病发生的潜在风险。通过认识和解决这种相互作用，有机会通过综合考虑神经和心血管健康的综合方法来改善患者结局和预后。此外，本研究进行的免疫细胞中介分析揭示了PD免疫疗法有前景的靶点和策略，为该疾病的发病机制和遗传基础提供了新的见解。这些发现为PD治疗中免疫调节的创新方法铺平了道路，并为在更广泛、更多样化的种族人群中探索免疫细胞表型在介导PD其他风险因素中的作用开辟了新途径。
5. 结论
总之，我们通过综合的MR分析，在遗传水平上确定了PD与CVD相关血浆蛋白之间复杂的因果关系。我们识别了三种CVD相关血浆蛋白与PD之间的显著相关性，并进一步对731种免疫表型进行了中介分析，确定了四种重要的免疫表型中介作用，强调了CVD相关血浆蛋白与PD之间相互作用的复杂模式。我们的研究为预防和治疗PD的临床实践提供了新的生物标志物和治疗靶点，也为研究者探索PD与CVD之间的关联开辟了新途径。
