《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：Distinct Proteomic Signatures Driving Progression of Sarcopenia: A Longitudinal Multicohort Study
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基于一项纵向多队列蛋白质组学研究，本研究通过高通量质谱分析，在发现与验证队列中鉴定并验证了7个与肌肉减少症（Sarcopenia）进展密切相关的核心血浆蛋白标记物（LRG1, CST3, TIMP1, C2, ITIH1, AMBP, LYZ）。研究表明，补体（Complement）激活、急性期（Acute phase）反应信号和LXR/RXR信号通路是驱动肌肉量、肌力和体能表现衰退的关键机制。这些发现为早期识别和干预肌肉减少症提供了新的分子靶点。
1 引言
肌肉减少症是一种与年龄相关的综合征，以进行性的肌肉质量、肌肉力量和体能表现的衰退为特征，可影响高达80岁以上50%的成年人，导致衰弱和不良健康结局。其病理生理机制涉及慢性炎症、代谢紊乱、神经肌肉退化和激素改变等多种因素，这些因素对肌肉量、肌力和体能表现的影响存在差异，提示肌肉减少症应被视为一个异质性的过程，而非单一过程。
尽管对肌肉减少症分子标志物的兴趣日益增加，但其进展和持续存在的机制仍未得到充分理解。值得注意的是，大多数研究依赖于横断面设计，限制了对其进展预测性生物标志物的洞察。因此，纵向研究至关重要，因为它们可能实现早期诊断和靶向干预，以减缓肌肉退化。此外，缺乏在独立队列中的验证也阻碍了已识别生物标志物的可重复性和普适性，对建立具有临床意义的蛋白质组学特征构成了挑战。有必要使用独立的、特征明确的队列进行稳健的验证，以确定用于肌肉减少症诊断、预后和治疗的生物标志物。
本研究采用高通量数据非依赖性采集质谱（DIA-MS）技术，全面分析了两组特征明确的纵向老年人队列的血浆蛋白质组。主要目标是识别并在外部验证与肌肉减少症随时间进展相关的循环蛋白。次要目标是探索不同的蛋白质特征是否与肌肉减少症特定组成部分（如肌肉量、肌力和体能表现）的衰退相关。
2 方法
2.1 研究参与者
本研究是一项纵向蛋白质组学研究，包括发现和验证两个阶段。发现队列来源于韩国衰弱与衰老队列研究，参与者被分为三组：(1) 基线及2年随访时均非肌肉减少症；(2) 新发肌肉减少症；(3) 持续性肌肉减少症。验证队列则使用了首尔国立大学盆唐医院的骨质疏松肌肉减少症队列。两队列均排除了患有神经肌肉疾病的参与者。
2.2 人口统计学变量
收集了包括年龄、性别、糖尿病、高血压、心血管疾病和脑血管疾病等共病在内的临床信息。测量了身高和体重，并计算了身体质量指数。
2.3 肌肉减少症评估
本研究采用亚洲肌肉减少症工作组2019年更新的定义，包括低肌肉质量、低肌力和/或低体能表现。肌肉质量通过双能X线吸收法评估，计算四肢骨骼肌质量指数。肌力通过液压握力计评估。体能表现通过包括平衡测试、4米步速测试和5次坐立测试在内的简易体能表现量表评估。
2.4 蛋白质组学分析
血浆样本制备采用一步蛋白消化法。蛋白质组学分析分发现和验证两阶段进行。发现队列采用数据非依赖性采集质谱分析。验证队列则采用靶向定量（高反应监测-DIA）和免疫分析法，以验证关键发现，并检测了21种额外的已知肌肉减少症相关标志物。两种平台在6种重叠蛋白上表现出强相关性，证实了数据集的可比性。
2.5 蛋白质组学数据处理
使用Spectronaut软件进行质谱数据处理和定量。缺失值采用实验观察到的低丰度信号分布的随机抽样进行填补。
2.6 统计分析
采用多变量回归分析评估每个生物标志物与肌肉减少症标准的关联，并调整年龄、性别、身体质量指数和类固醇使用等因素。通过Perseus软件进行差异表达蛋白分析和相关性分析。
2.7 生物信息学分析
使用Ingenuity Pathway Analysis进行经典通路富集分析。利用String数据库获取蛋白质-蛋白质相互作用，并使用Cytoscape软件构建网络模型。
3 结果
3.1 参与者的基线特征
在发现队列中，三组参与者在年龄、性别和身体质量指数方面基线特征相似，但持续性肌肉减少症组的女性比例显著较低。与稳定非肌肉减少症组相比，新发肌肉减少症组的四肢骨骼肌质量和握力在2年随访期间的下降最为显著。验证队列的女性比例更高、年龄更年轻，且基线肌肉质量和体能表现指标显著更低，但两组随访时长可比。
3.2 组间差异表达蛋白
通过三组间的两两比较，发现了与肌肉减少症进展相关的差异表达蛋白。例如，与新发肌肉减少症组相比，持续性肌肉减少症组的B2M和LYZ表达上调。APOA1和KLKB1在组间也存在显著差异。不同比较组之间的差异表达蛋白重叠情况显示，有10个蛋白在“稳定非减少症 vs. 持续性减少症”和“新发减少症 vs. 持续性减少症”两组比较中共享，表明这些蛋白可能是肌肉减少症持续存在的共同分子特征。但没有蛋白在三组比较中均独占共享，提示不同进展阶段具有不同的蛋白质组学特征。
3.3 与肌肉减少症各组分显著相关的蛋白
进一步分析了蛋白丰度与肌肉量、肌力和体能表现三个关键组分之间的相关性。研究发现，大多数蛋白仅与单一组分相关，仅有少量蛋白在至少两个组分间重叠，而只有CST3蛋白与所有三个组分均相关。在分析纵向变化时，没有发现蛋白在所有三个纵向变化领域重叠，这突显了驱动肌肉减少症进展的生物通路具有异质性。
3.4 与肌肉减少症组分相关的PPI网络中的关键蛋白
为阐明肌肉量、肌力和体能表现背后的分子机制，构建了与各参数显著相关的蛋白质-蛋白质相互作用网络。肌肉量网络识别出COMP、C2、ITIH4和C1QB等关键蛋白，提示细胞外基质重塑和免疫激活在肌肉维持中的作用。涉及肌肉量随时间变化的网络中，S100A8、S100A9等炎症相关蛋白以及CLU、APOA1等与脂质代谢和免疫反应相关的蛋白较为突出。与肌力相关的网络中，补体系统蛋白（C5, C7, C9, FCN3）以及与免疫调节、细胞骨架稳定相关的蛋白（如ALB, CD14）被强化。体能表现网络则揭示了与凝血、血管通路相关的蛋白（如FGG, SERPINF2, A2M）的潜在作用。
3.5 与肌肉减少症组分相关的富集通路
通路富集分析显示，补体级联是肌肉量最富集的通路。其他显著富集的通路包括LXR/RXR激活、糖酵解、中性粒细胞脱颗粒和整合素信号传导。在分析肌肉量随时间变化时，与补体激活和动脉粥样硬化信号相关的通路也很突出。肌力网络在补体级联、清道夫受体结合和免疫细胞通讯通路上显著富集。体能表现的通路富集则显示出血管相互作用和免疫调节的不同参与。这些通路在发现和验证队列中表现出高度一致性。
3.6 发现队列中显著蛋白在验证队列中的验证
为确认研究结果的稳健性，优先识别了在发现和验证队列中均与肌肉减少症组分呈一致显著关联的蛋白。最终鉴定出7个关键蛋白：LRG1、CST3、TIMP1、C2、ITIH1、AMBP和LYZ，它们在两个队列中均显示出方向一致且具有统计学意义的关联。具体而言，LRG1和TIMP1与肌力呈可重复的负相关；CST3与体能表现呈一致的正相关；C2被确认为与肌肉量呈负相关的显著标志物。在生物通路方面，LXR/RXR激活和急性期反应信号通路在两个数据集中均表现出强富集，尤其是在体能表现和肌力方面。补体级联也表现出一致的富集，强化了免疫介导机制作为肌肉减少症进展的普遍驱动因素。
4 讨论
本研究通过在两个独立的前瞻性队列中进行蛋白质组学分析，发现了与肌肉减少症进展相关的关键通路，包括补体激活、脂质代谢和急性期反应信号。七种稳健的蛋白特征在外部队列中得到方向一致的验证，支持其作为可靠进展生物标志物的潜力。次要分析揭示了与肌肉量、肌力和体能表现衰退相关的不同蛋白质和通路，支持了各组分背后生物学驱动因素的机制异质性。
研究结果强调了脂质代谢，特别是LXR/RXR信号，作为两个队列中肌肉量和体能表现的关键调节因子。尽管该通路主要在胆固醇稳态中被研究，但新证据表明脂质转运失调会影响肌肉生理。补体激活是另一个一致富集的通路，其中C2、C7、C9和C4BPB等蛋白被验证与肌肉减少症进展相关。这些蛋白也被验证为与肌肉量、功能和体能表现变化相关的生物标志物。尽管关于这些因子与肌肉健康直接关联的文献有限，但多项研究表明补体通路相关因子与肌肉健康密切相关。
尽管发现队列（社区基础）和验证队列（临床富集）的基线特征存在差异，但这种异质性反映了肌肉减少症更广泛的临床谱系。然而，关键的蛋白-通路关联，特别是与补体激活和脂质代谢相关的关联，在队列间方向一致，表明它们捕捉了驱动肌肉减少症进展的基本生物学过程。这种跨环境的一致性增强了外部效度。
本研究的优势包括采用纵向设计和外部验证，增强了生物标志物发现的可靠性和普适性；高通量蛋白质组学实现了对肌肉减少症进展和持续性的无偏倚深度分子表征；区分了肌肉减少症的三个组分，揭示了各自不同的生物学通路；关键生物标志物在独立队列中得到验证；整合了严谨的统计分析、PPI网络建模和通路富集分析。研究还将肌肉减少症与系统性衰老机制（如补体激活、脂质代谢和免疫调节）联系起来。
然而，本研究也存在一些局限性。样本量有限；质谱分析可能存在批次效应和技术变异；蛋白质组学分析依赖于血浆样本，可能无法检测到某些低丰度的生物活性肽；研究结果是观察性的，需要功能验证来确认因果关系；队列仅限于亚洲人群，限制了其普适性；验证队列来源于骨质疏松症临床队列，可能不能完全代表患有肌肉减少症的普通老年人群；随访时间可能未能捕捉长期轨迹。
总之，本研究识别并验证了与肌肉减少症进展相关的循环蛋白和通路，其中补体激活和脂质代谢成为关键机制。这些发现为肌肉减少症的早期诊断、风险分层和治疗靶向提供了基础。需要进一步的机制研究和多族群验证以确立这些生物标志物的临床效用。
