用于研究晶状体上皮细胞中铁死亡（ferroptosis）及其在糖尿病性白内障进展中作用的方法学途径

《Methods》：Methodological approaches for dissecting ferroptosis in lens epithelial cells and its role in diabetic cataract progression

糖尿病性白内障中ferroptosis的机制研究揭示，高血糖通过降低USP47与VDAC3的结合，导致VDAC3泛素化降解，引发ROS积累和脂质过氧化，从而激活ferroptosis通路。

　　

徐浩然|王文静|李建桥|赵晓菲|张涵

山东大学齐鲁医学院眼科，济南250033，中国

摘要

糖尿病性白内障已成为糖尿病眼部并发症中导致失明的第二大疾病。铁死亡（Ferroptosis）是许多与糖尿病相关的并发症的罪魁祸首，但其在糖尿病性白内障中的作用尚未得到研究。在本研究中，我们首次证实，在高葡萄糖条件下，铁死亡被激活，这表现为转铁蛋白受体1（CD71）和溶质载体家族7成员11（SLC7A11）的水平升高、脂质过氧化以及总铁和Fe²⁺的增加。此外，电压依赖性阴离子通道3（VDAC3）在高葡萄糖水平下在体内和体外都表现出降低。VDAC3的敲低导致活性氧（ROS）水平升高和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）水平下降，表明VDAC3的减少通过ROS诱导的脂质过氧化来调节糖尿病性白内障中的铁死亡。进一步研究发现，高葡萄糖处理的晶状体上皮细胞中泛素特异性肽酶47（USP47）的水平降低。我们发现USP47与VDAC3结合并调节其去泛素化。在高葡萄糖条件下，这种结合减弱，VDAC3随后被泛素化并降解，最终导致铁死亡和糖尿病性白内障。总体而言，我们验证了USP47-VDAC3-ROS/NADH轴在高葡萄糖处理的晶状体上皮细胞（LEC）和糖尿病性白内障动物模型中调节铁死亡。我们的发现增进了对人类糖尿病性白内障的理解，并为医学和技术上治疗糖尿病性白内障提供了重要的机制见解。

引言

糖尿病已成为世界上最常见的慢性疾病之一[1]。在该疾病的主要并发症中，糖尿病性白内障是导致失明的第二大原因[2],[3]。然而，糖尿病性白内障的机制尚未完全阐明[4]。尽管白内障手术适用于大多数白内障病例，但糖尿病患者发生手术并发症的风险更高[5]。因此，阐明糖尿病性白内障的机制并寻找预防或延缓其进展的策略非常重要。

铁死亡（Ferroptosis）由Dixon等人于2012年首次定义[6]，最终导致脂质过氧化和生物膜不稳定。在铁死亡过程中，细胞内氧化呼吸链产生的未配对电子参与芬顿反应（Fenton reaction），氧化细胞膜中的多不饱和脂肪酸磷脂分子。氧化的磷脂会破坏磷脂双层的结构，导致膜破裂并最终引起细胞死亡[7]。铁死亡作为一种新发现的细胞死亡途径，已被证实参与肿瘤发生、炎症和糖尿病并发症等[8]。

在白内障发病机制中，晶状体上皮细胞（LEC）被认为是维持晶状体代谢稳态、清除晶状体内ROS等的重要调节因子[9]。研究表明，ROS可以触发铁死亡，而ROS被广泛认为是白内障的强诱导因素[10]。此外，铁死亡直接参与年龄相关性白内障的发生和发展，通过诱导LEC死亡和在透明晶状体内积累ROS[11]。最近的研究阐明了铁死亡在年龄相关性白内障中的致病性，包括SIRT6/p-Nrf2/GPX4和SIRT6/NCOA4/FTH1通路的调控[12]。然而，目前尚不清楚铁死亡是否参与糖尿病性白内障的发生和发展及其潜在的调控机制。

作为VDAC家族的成员，VDAC3在许多生理过程和疾病的启动和发展中起着关键的调节作用[13],[14]。更重要的是，VDAC3被认为是嘧啶复合物的核心因子，后者可以通过生成CoQ₁₀H₂来促进铁死亡，而CoQ₁₀H₂是铁死亡抑制蛋白1的底物，可防止铁死亡过程中的脂质过氧化。VDAC3的敲低增加了细胞对RSL3和erastin等铁死亡诱导剂的敏感性[15]。此外，NADH被发现是铁死亡抑制蛋白1的底物，并参与年龄相关性黄斑变性的铁死亡过程[16]。先前的研究还证实VDAC3通过多种途径调节铁死亡，如HSPB1和GPX4通路[17],[18]。然而，VDAC3是否参与糖尿病性白内障及其潜在的调控机制尚未被报道。

磷酸化、乙酰化和泛素化已被预测为VDAC3的蛋白质修饰（UniProt）。关于VDAC3蛋白质修饰的研究相对较少。在泛素化方面，FBXW7已被证明可导致胃癌中的VDAC3降解，但迄今为止，尚无关于VDAC3在糖尿病性白内障进展中的去泛素化调控的研究[19]。

在我们的研究中，我们探讨了铁死亡在糖尿病性白内障中的作用及其潜在的调控机制。我们验证了USP47-VDAC3-ROS/NADH轴在暴露于异常高葡萄糖水平的晶状体上皮细胞（LEC）和糖尿病性白内障动物模型中调节铁死亡。我们的发现为人类糖尿病性白内障的发病机制提供了重要的机制见解和潜在的治疗方法。

试剂

抗SLC7A11兔单克隆抗体（货号GB 13030–2）和抗CD71兔单克隆抗体（货号D7G9X）购自Cell Signal Transduction Technology Co., Ltd.（美国马萨诸塞州）。抗VDAC3兔单克隆抗体（货号55260–1-AP）购自Proteintech Technology Co., Ltd.（中国武汉）。抗USP47兔单克隆抗体（货号DF15013）购自Affinity Technology Co., Ltd.（中国江苏）。MTT试剂（货号ST316）、MDA（丙二醛）检测试剂盒（货号S0131S）、NADH检测试剂盒（货号S0175）等。

过量葡萄糖诱导晶状体上皮细胞（LEC）中的铁死亡

为了验证过量葡萄糖的致死效应并确定其适当浓度，我们在同一实验中用六种不同的葡萄糖浓度处理两种上皮细胞株SRA01/04和HLE-B3，时间分别为24小时、48小时和72小时。使用MTT检测方法确定细胞的存活率。随着葡萄糖浓度的增加，SRA-01/04和HLE-B3细胞的存活率逐渐下降。然而，在这三个时间点中，长时间处理并未

讨论

眼睛如何保持晶状体的透明性是研究人员几十年来一直在研究的过程。晶状体上皮细胞（LEC）作为距离晶状体最近的功能细胞，与晶状体的透明性密切相关。在胚胎阶段，LEC增殖并分化为晶状体纤维，后者形成晶体晶状体。成熟后，LEC通过参与物质合成、运输和代谢以及有丝分裂和增殖来帮助维持晶状体的透明性[9]。

出版同意

不适用。

伦理批准和参与同意

该研究获得了山东第一医科大学附属医院的伦理委员会批准，并遵循了《赫尔辛基宣言》的指导原则。

作者贡献声明

徐浩然：验证、可视化、初稿撰写、审阅与编辑、数据管理、正式分析、实验设计、方法学。王文静：方法学、验证。李建桥：概念构思、监督、方法学。赵晓菲：概念构思、实验设计、方法学、监督、审阅与编辑。张涵：概念构思、实验设计、监督。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（编号81873677）和山东省自然科学基金（编号ZR2020QH147）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。