《Environmental Microbiology Reports》：Pollinator Visitation Alters Cranberry Flower Fungal Communities in Wisconsin Cranberry Agroecosystems
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本文综述了一项为期两年的研究，深入探讨了授粉昆虫访问如何塑造威斯康星蔓越莓（Vaccinium macrocarpon Ait.）花朵的真菌群落。研究通过传统培养和下一代测序（NGS）方法，对比分析了蔓越莓花朵、多种授粉昆虫（蜜蜂、熊蜂、野生独居蜂、食蚜蝇）及周边野花中的共享真菌。核心发现包括：与隔绝昆虫访问的“帐篷处理”花朵相比，开放给授粉者的花朵具有更高的真菌丰度与丰富度；研究首次证明了授粉昆虫与栽培蔓越莓花朵之间存在共享的真菌群落，并识别出在食蚜蝇（Toxomerus sp.）样本中检测到的蔓越莓果实腐烂病（CFR）真菌复合体成员比例最高，这为理解该重要农作物病害的传播与发生提供了新的生态学视角。
引言
花微生物组在被子植物及其授粉者的生态与演化中扮演着重要角色。尽管花期短暂，花朵仍承载着丰富的细菌和真菌群落。微生物已知可“搭便车”于蜜蜂等昆虫，在理想资源地点间移动。在蔓越莓农业生态系统中，盛花期是蔓越莓果实腐烂病（CFR）复合体内病原体侵染的脆弱时期，该病害是北美蔓越莓产业面临的最普遍威胁，可导致部分地区高达100%的作物损失。CFR复合体包含10-15个真菌属。了解蔓越莓花朵真菌群落的组成与组装动态，对于阐明蔓越莓微生物组与作物健康的关系至关重要。本研究假设蜜蜂和蝇类对花朵的访问会增加蔓越莓花朵的真菌丰富度和丰度。
材料与方法
研究于2023和2024年的蔓越莓盛花期，在威斯康星州中部的八个蔓越莓沼泽进行。样本包括蔓越莓花朵、野花及授粉昆虫（蜜蜂、熊蜂、野生独居蜂、食蚜蝇）。在蔓越莓田内设置了两种处理：1）“帐篷处理”，使用白色聚丙烯花园罩布阻止昆虫访问1m2区域内的花朵；2）“开放处理”，允许授粉者访问。采用传统培养（使用酸化PDA和YPM培养基）和基于CTAB法的DNA提取结合Illumina平台对ITS2区进行下一代测序（NGS）两种方法分析真菌群落。生物信息学分析使用QIIME2软件和UNITE数据库。统计分析包括Alpha多样性（香农指数、优势度指数、皮洛均匀度指数）和Beta多样性（基于Bray-Curtis距离的PerMANOVA）比较，并定义了“核心群落”（在至少75%的组内样本中出现的分类单元）。
结果
3.1 野花、蜜蜂和蝇类的鉴定
2023-2024年共收集到32种植物和16个蜜蜂属。2023年被动收集的蜜蜂中意大利蜜蜂（Apis mellifera）占主导（97.5%）。2024年主动收集的食蚜蝇均属Toxomerus属。最常见的野花包括白三叶草（Trifolium repens）等。
3.2 蔓越莓花朵上的授粉者访问观察
共记录了63次观察，访问者主要为意大利蜜蜂和蝇类，未观察到熊蜂或其他野生蜂访问。意大利蜜蜂的访问在七月显著高于六月。
3.3 基于培养法的花朵与昆虫真菌组表征
从2544份培养物中鉴定出186个独特形态型，并确定了培养中最常检测到的15个真菌属，包括枝孢菌（Cladosporium）、谢弗雷氏酵母（Scheffersomyces）、镰刀菌（Fusarium）等，其中包含5种酵母。不同样本类型（蔓越莓花、意大利蜜蜂、野生蜂、野花）在这些属的检测频率上存在显著差异。属于CFR复合体的Allantophomopsis属在培养中检测到10次。
3.4 基于下一代测序的花朵与昆虫真菌组表征
NGS共鉴定出542个真菌属。蔓越莓花朵中相对丰度最高的属是Setomelanomma（31.2%）。野花样本中大部分序列无法在数据库中进行更精细分类。食蚜蝇样本中Aureobasidium的相对丰度最高（25.6%）。Alpha多样性分析显示，意大利蜜蜂样本的香农多样性指数最高（3.45），野花最低（0.02）。开放与帐篷处理的蔓越莓花在Alpha多样性指标上无显著差异，但开放处理的花朵各项平均值略高。Bray-Curtis差异的PerMANOVA分析表明不同样本类型间的真菌群落组成存在显著差异，但开放与帐篷处理的蔓越莓花之间无显著差异。
3.5 昆虫与花朵核心群落成分的鉴定
蔓越莓花朵的核心群落（在≥75%样本中出现）包括Setomelanomma、Rachicladosporium和Taphrina。意大利蜜蜂的核心属包括Setomelanomma、Taphrina和Filobasidium。熊蜂的核心属包括Setomelanomma、Rachicladosporium、Fusarium、Aspergillus和Diplodia。Setomelanomma和Rachicladosporium是蔓越莓花与两种社会性蜜蜂共享的核心真菌。食蚜蝇的核心属是Malassezia和Vishniacozyma。野生独居蜂未鉴定出核心属。
3.6 蔓越莓帐篷处理间真菌群落的比较
所有通过培养鉴定的属在开放和帐篷处理的蔓越莓花中均有发现，但多数丝状真菌属在开放花朵中的培养检测频率更高。平均而言，每个属在开放花朵中的检测次数比帐篷处理多12.4次，丝状真菌的检测频率差异显著，而酵母差异不显著。NGS数据显示，开放花朵中鉴定出的真菌属（119个）显著多于帐篷处理花朵（82个）。酵母类群如Pichia和Metschnikowia仅在开放花朵中检测到。
3.7 蔓越莓果实腐烂病病原体及相关酵母的检测
多个CFR病原体（如Coleophoma cylindrospora, Phomopsis vaccinii, Phyllosticta vaccinii, Physalospora vaccinii）及相关酵母（如Hanseniaspora uvarum）在蔓越莓花和昆虫样本中检出，但未在野花中检出。CFR真菌在食蚜蝇样本中检测比例最高（50%的样本至少含有一种CFR真菌），其中Phyllosticta vaccinii的检出率高达25%。熊蜂样本中也有较高比例（30.8%）含有CFR真菌。开放给昆虫访问的蔓越莓花比帐篷处理的花检出更多CFR真菌，且相关酵母仅在第二次采集期（7月）检出。
讨论
本研究证实了蔓越莓花朵与授粉昆虫之间存在真菌群落重叠，且授粉访问可能增加花朵的真菌丰度与丰富度。共享核心群落的存在，特别是与环境（如枯枝落叶）相关的Setomelanomma和Rachicladosporium，提示了环境真菌通过昆虫在系统中传播的可能。帐篷处理虽然主要影响昆虫访问，但无法完全排除其对微气候（如湿度、紫外线）和风、水传播的潜在影响，然而观察到的真菌丰度下降趋势与帐篷可能更利于真菌生长的预期相反，支持了昆虫访问的贡献。
研究方法的局限性包括2023年使用的粘虫陷阱法导致熊蜂等大型蜂类代表性不足，以及野生蜂样本量较小，这可能影响了对其核心真菌群的界定。本研究首次在农业生态系统中，综合评估了包括食蚜蝇在内的多种授粉昆虫类群对整体花朵真菌群落（而非特定病原或酵母）的贡献，揭示了环境中大量尚未在基因数据库中可靠表征的真菌多样性。
研究结果对蔓越莓健康管理具有重要意义：CFR病原体在访问频率最高的食蚜蝇和意大利蜜蜂以及开放花朵中检出率最高，而在野花和野生蜂中检出极少，提示食蚜蝇和蜜蜂可能是CFR病原体的潜在传播者，而野花和野生蜂可能不是重要的病原库。食蚜蝇的高检出率可能与其幼虫在土壤中生活、取食含病原的腐烂有机物有关。需要强调的是，在昆虫样本中检出并不等同于其具有传病能力，这需要后续研究验证。
从授粉者健康角度，社会性蜜蜂样本中检出了蜜蜂病原菌黄曲霉（Aspergillus flavus），引发了对其健康风险的关注。同时，频繁检出的Aureobasidium pullulans是一种已知的生物防治菌，在草莓、葡萄等作物上用于防治灰霉病，其在蔓越莓系统中对CFR病原菌的潜在生防价值值得未来探索。此外，盛花期使用的杀菌剂可能非靶向地改变花朵真菌群落及授粉者微生物组，其影响尚不明确。
结论
本研究提供了证据，表明蔓越莓系统中的授粉昆虫与花朵共享真菌群落，且授粉访问可能增加蔓越莓花朵的真菌丰富度和丰度。蔓越莓花朵中“核心”的真菌成分也是意大利蜜蜂和熊蜂访花者的核心组成部分。蔓越莓果实腐烂病（CFR）真菌在授粉昆虫中检出，但未在邻近的野花群落中检出。未来研究应关注盛花期花朵真菌多样性增加对蔓越莓果实健康的影响。
