《Microbiological Research》：Deciphering the role of ergosterol and sphingolipids in the antifungal mode of action of rhamnolipids on Sclerotiniaceae.
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为解决传统化学农药抗性及环境危害问题，本研究聚焦于生物表面活性剂鼠李糖脂（RLs）的抗真菌机制。研究人员通过CRISPR-Cas9基因编辑、药理学和脂质组学方法，深入探究了植物病原真菌（灰葡萄孢和核盘菌）质膜中两种主要脂质——麦角固醇和鞘脂在RLs作用中的拮抗作用。结果表明，麦角固醇含量的降低减弱了RLs的抗真菌活性，而鞘脂（特别是神经酰胺和酸性鞘糖脂）则能保护真菌细胞膜免受RLs的透化作用。这项研究在体内证实了两种关键膜脂的拮抗角色，为未来基于脂质组学设计高效的RLs生物防治策略提供了关键见解。
在农业生产中，由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病和由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的菌核病是两大极具破坏性的植物病害，每年在全球范围内造成数百亿美元的经济损失。长期以来，农业防治高度依赖化学合成杀菌剂，但这导致了病原菌抗药性的出现、环境污染以及对人类健康的潜在威胁。寻求高效、环保的替代方案迫在眉睫。鼠李糖脂（Rhamnolipids, RLs）作为一种主要由铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的天然糖脂，以其良好的生物降解性、低毒性和显著的抗真菌活性，成为极具潜力的生物农药候选者。RLs能够抑制孢子萌发、透化菌丝细胞并抑制菌丝生长，但其对核盘菌科真菌的具体作用机制尚未完全阐明。此前的研究表明，RLs是一种膜靶向化合物，对真菌质膜脂质具有亲和力，但质膜中不同脂质成分，如主要固醇麦角固醇和鞘脂，在RLs抗真菌活性中扮演何种角色，仍需在活体真菌中得到验证。这正是本项研究的核心出发点。
为深入探索这一问题，研究团队综合运用了多种关键技术方法。首先，他们利用CRISPR-Cas9介导的同源重组技术，成功构建了灰葡萄孢的麦角固醇生物合成途径基因（Erg11和Erg5）的敲低（Knock Down, KD）和敲除（Knock Out, KO）突变体。其次，通过药理学方法，使用多烯类抗生素纳他霉素（与麦角固醇特异性结合）、鞘脂合成抑制剂多球壳菌素（Myriocin）和酸性鞘糖脂合成抑制剂奥雷巴菌素A（Aureobasidin A）进行共处理实验，评估这些脂质在RLs活性中的作用。此外，研究采用高效薄层色谱（HPTLC）和超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS和UPLC-QTOF）等脂质组学技术，精确量化了真菌菌丝中的麦角固醇、总固醇以及各类鞘脂（如神经酰胺、半乳糖神经酰胺、葡萄糖神经酰胺）的含量。
3.1. 灰葡萄孢麦角固醇生物合成途径突变体
研究团队成功获得了灰葡萄孢的Erg11 KD突变体（KDErg11#3, #6, #9, #14）以及Erg5的KO突变体（KOErg5#11, #16）和KD突变体（KDErg5#17, #23）。通过UPLC-MS/MS分析证实，这些突变体的菌丝麦角固醇含量显著低于野生型（WT），尤其是KOErg5突变体中仅含微量麦角固醇。进一步通过UPLC-QTOF分析发现，KOErg5突变体中积累了质荷比（m/z）为381.3 u和663.5 u的未知化合物，可能为麦角固醇合成途径受阻后产生的其他固醇类物质。
3.2. 灰葡萄孢麦角固醇生物合成途径突变体对RLs的敏感性
通过测量菌落径向生长抑制率，研究发现麦角固醇含量的降低与真菌对RLs敏感性的下降直接相关。与野生型相比，所有突变体对RLs（25 μg·mL-1）的生长抑制率均有不同程度的降低，在KOErg5突变体中尤为明显。这直接证实了麦角固醇在RLs抗真菌活性中的关键作用。
3.3. 纳他霉素对RLs透化菌丝的影响
为探究麦角固醇的作用是否涉及其可及性，研究使用能与麦角固醇特异性结合的纳他霉素与RLs进行共处理。共聚焦显微镜观察SYTOX? Green染色结果显示，与单独使用RLs相比，RLs与纳他霉素共处理显著降低了灰葡萄孢和核盘菌菌丝的透化比例。这表明纳他霉素通过占据麦角固醇结合位点，阻碍了RLs与麦角固醇的相互作用，从而削弱了RLs的透化效应。
3.4. 鞘脂参与真菌对RLs的耐受性
使用鞘脂合成抑制剂多球壳菌素与RLs共处理，产生了与纳他霉素相反的效果。共处理显著增强了RLs对灰葡萄孢和核盘菌菌丝的透化作用。这一结果强烈提示，鞘脂的存在对真菌细胞膜具有保护作用，能够抵抗RLs诱导的透化。
3.5. 鞘脂分析
通过HPTLC定量分析，研究人员首次系统比较了两种真菌的鞘脂组成。发现神经酰胺是两者最主要的鞘脂类别，且灰葡萄孢中的神经酰胺含量显著高于核盘菌。而半乳糖神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的含量在两种真菌间无显著差异。在所有的Erg11和Erg5突变体中，鞘脂含量与野生型无统计学差异，表明麦角固醇途径的突变未直接影响鞘脂代谢。
3.6. 酸性鞘糖脂在真菌对RLs敏感性中的参与
使用酸性鞘糖脂合成抑制剂奥雷巴菌素A与RLs共处理，显著增强了RLs对灰葡萄孢菌丝的透化，但对核盘菌无此效应。这表明酸性鞘糖脂（如肌醇磷酸神经酰胺IPCs）在灰葡萄孢中对RLs的耐受性有贡献，而这种作用在核盘菌中可能不同，暗示两种真菌的酸性鞘糖脂组成或功能存在差异。
本研究在体内证实了真菌质膜中两种主要脂质——麦角固醇和鞘脂在RLs抗真菌作用中扮演着相互拮抗的角色。一方面，麦角固醇是RLs发挥高效抗真菌活性的“助推器”。RLs可能通过范德华力等相互作用与麦角固醇结合，其结构的特异性（相较于其他固醇如胆固醇）对RLs诱导的膜流动性增加至关重要。当麦角固醇含量降低或被纳他霉素结合时，RLs的透化能力和抗真菌效果随之减弱。另一方面，鞘脂，特别是神经酰胺和酸性鞘糖脂，则充当了细胞膜的“稳定剂”和“保护盾”。它们能够增加膜的有序性，可能通过形成脂筏（raft）或凝胶域（gel domain）来加固膜结构，从而阻碍RLs的插入和透化作用。灰葡萄孢相比核盘菌对RLs敏感性较低，可能与其具有更高的神经酰胺含量以及特定的酸性鞘糖脂组成有关。
这项发表于《Microbiological Research》的研究具有重要的理论与实践意义。它不仅首次在活体病原真菌中明确了麦角固醇和鞘脂在RLs膜靶向作用中的具体机制，还为基于脂质组学的精准生物防治策略提供了新思路。未来，在开发和应用RLs作为生物农药时，需要充分考虑不同病原真菌乃至不同菌株间质膜脂质组成的差异。通过监测或调控病原菌的脂质代谢，有望优化RLs的使用效率，或设计出能克服鞘脂保护作用的RLs衍生物，从而为可持续农业提供更强大、更智能的绿色武器。
