一种用于快速、超高灵敏度检测食品微生物污染的表面增强拉曼散射的可靠方法

《Microchemical Journal》：A robust approach for rapid and ultrasensitive surface-enhanced Raman scattering detection of food microbial contamination

基于金纳米星的三合一aptamer探针SERS生物传感器可快速检测食品中的白念珠菌，30分钟内实现饮用水、果酱和牛奶中1.14-1.21 CFU/mL的检测限，与常规平板计数法结果一致（RSD<10%）。

　　

王红艳|谢张富|蒲发祥|陶毅

浙江工业大学药学院，中国杭州310014

摘要

白色念珠菌是一种关键的食源性污染物，可在24-48小时内导致食品迅速变质，并对免疫系统受损的人群构成感染风险。然而，现有的检测方法受到长时间培养（3-5天）和复杂食品基质干扰的限制。为了克服这些限制，我们开发了一种基于适配体的SERS生物传感器，采用了“三合一”探针设计，将拉曼报告分子和白色念珠菌特异性适配体共组装到金纳米星（AuNSs）上。该生物传感器对白色念珠菌具有出色的特异性和稳定的信号强度，能够实现快速检测。在目标识别后，1074 cm^?1处的特征拉曼峰显示出1.66×10的显著信号增强因子（Liang等人，2024⁸）。该生物传感器能够在30分钟内快速定量检测复杂食品基质中的白色念珠菌，在饮用水中的检测限（LOD）为1.14 CFU·mL^?1，在果酱中为1.21 CFU·mL^?1，在牛奶中为1.17 CFU·mL^?1。基于SERS的方法与传统平板计数方法的结果高度一致，相对标准偏差（RSD）低于10%，回收率始终在90-110%的范围内。这些结果验证了该方法的高灵敏度和准确性，使其成为常规监测和控制食源性微生物污染的有前景的工具。

引言

确保食品安全仍然是全球公共卫生的关键优先事项，因为微生物污染持续威胁消费者健康并造成巨大的经济损失。在多种导致食品变质的微生物中，酵母已成为主要问题，尤其是在富含可发酵糖和酸的产品中。白色念珠菌由于其显著的生理适应性和快速繁殖能力，已成为高糖基质中的主要污染物，能够在24-48小时内引发变质[1]。除了在食品劣化中的作用外，白色念珠菌还是一种重要的机会性人类病原体，对免疫系统受损的个体构成感染风险。其在食品加工设备上形成顽固生物膜的趋势进一步增加了灭菌成本和生产损失。因此，开发快速、灵敏和可靠的白色念珠菌检测方法对于有效的食品质量控制和公共卫生保护至关重要[2]。

传统的白色念珠菌检测方法主要依赖于基于培养的技术，例如在选择性培养基（如Sabouraud琼脂）上分离后进行形态学鉴定。虽然这种方法被视为参考标准，但它耗时较长，通常需要3-5天才能确认结果，并且灵敏度有限（大约10²-10³ CFU·mL^?1）。为了解决这些限制，人们探索了各种先进技术，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和电化学传感器[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。尽管这些方法提高了灵敏度并减少了分析时间，但它们通常涉及复杂的样品制备，需要精密的仪器，或者面临来自复杂食品基质的干扰问题。因此，迫切需要一种结合快速性、高灵敏度、操作简便性和稳健性的新型检测方法，以适用于现场或常规监测。

表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种强大的病原体检测技术受到了广泛关注，因为它具有出色的灵敏度、快速响应能力和提供独特分子指纹信息的能力[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]。SERS中的显著信号增强主要源于与纳米结构金属基底（如金（Au）和银（Ag）纳米粒子）上的局部表面等离子体共振相关的电磁机制。SERS生物传感器的性能在很大程度上取决于基底设计和目标识别策略。用特定的生物识别元件（如抗体或适配体）对SERS活性纳米结构进行功能化，可以实现目标分析物的选择性捕获和信号转导。适配体作为合成的单链DNA或RNA分子，具有高亲和力和特异性、易于合成和修饰以及比抗体更优越的稳定性，使其成为生物传感器开发的理想识别单元。

SERS基底工程的最新进展进一步扩展了检测能力。尽管现有的SERS适配体传感器显示出潜力，但由于传统球形纳米粒子或纳米棒的固有限制，它们在真实食品样品中的灵敏度或重复性往往不足，这些纳米粒子提供的热点密度和信号增强有限[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。金纳米星（AuNSs）作为一种更优的替代品出现，其独特的分支形态带来了显著的优势。这种结构在尖端和分支连接处生成丰富的电磁“热点”，在那里局部表面等离子体共振被显著放大，从而实现极高的信号增强因子，通常比球形纳米粒子高出几个数量级。重要的是，这些分支的密度和分布可以在合成过程中精确控制，从而实现可调的光学特性和批次间重复性的提高。这一效果通过合成过程中加入的银进一步放大，银形成了具有协同等离子体特性的双金属AgAu结构。银成分不仅通过等离子体耦合增强了电磁场，还有助于缩小等离子体线宽并提高化学稳定性，共同产生了更强烈和可靠的SERS信号。这些形态和组成的优势使AuNSs成为开发即使在复杂食品基质中也能保持高灵敏度和重复性的稳健SERS生物传感器的理想平台。

在这里，我们采用了“三合一”探针设计，将拉曼报告分子和适配体共组装到AuNSs上，确保了SERS检测白色念珠菌时的出色特异性和稳定的信号强度。如图1所示，金纳米星（AuNSs）通过种子介导的生长方法合成，作为核心的SERS增强基底。AuNSs被拉曼报告分子功能化，随后与白色念珠菌特异性适配体结合形成靶向SERS探针。在识别并结合目标细菌后，生物传感器产生特征性的、显著增强的拉曼信号，从而在30分钟内实现白色念珠菌的定量检测。该平台展示了高灵敏度、出色的特异性和在多种食品基质中的可靠性能，为推进快速食品安全监测提供了有前景的工具。

实验试剂

三钠柠檬酸二水合物（C?H?Na?O?·2H?O，≥99%）和四氯金酸三水合物（HAuCl?·3H?O，≥99%）购自Sigma-Aldrich（美国）。l-抗坏血酸（≥99.7%）来自Sinopharm Chemical Reagent Co。硝酸银（AgNO?，≥99.8%）来自Alfa Aesar。盐酸（HCl，分析级）、4-巯基苯硼酸（4-MPBA，95%）和罗丹明6G（R6G，分析级）由上海Titan Technology Co.和上海McLean Biochemical提供

材料形态和组成分析

合成的金种子和金纳米星首先通过透射电子显微镜（TEM）和UV–Vis光谱进行了表征。TEM图像显示了不同的形态。金种子呈现出均匀的球形，平均直径为20 nm（图2A和D），而AuNSs显示出具有尖锐尖端的特征性分支结构，平均尺寸为60 nm（图2B和E）。相应的UV–Vis光谱显示了局部表面等离子体共振（LSPR）峰

结论

我们开发了一种高度灵敏和快速的SERS生物传感器，用于检测食品基质中的白色念珠菌。该生物传感器使用带有特定适配体和拉曼报告分子4-MPBA的金纳米星，实现了选择性的目标识别和信号转导。它在30分钟内实现了快速检测，具有宽的线性范围和出色的灵敏度，检测限在饮用水中低至1.14、果酱中为1.21、牛奶中为1.17 CFU·mL^?1

CRediT作者贡献声明

王红艳：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。谢张富：验证、资源、方法学、正式分析。蒲发祥：撰写——审阅与编辑、验证、方法学。陶毅：撰写——审阅与编辑、监督、正式分析、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

感谢中国国家重点研发计划（编号2024YFC3506904）的财政支持。作者感谢匿名审稿人的宝贵建议，这些建议有助于改进手稿。