Nanozyme-CRISPR/Cas12a对DNA甲基化的可视化检测

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《Microchemical Journal》：Nanozyme-CRISPR/Cas12a visual sensing of DNA methylation

【字体：大中小】 时间：2026年03月07日 来源：Microchemical Journal 5.1

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　　DNA甲基化检测方法，CRISPR/Cas12a系统，纳米酶催化，磁性分离，可视化检测

王志通|林佩文|严瑞仪|姚永超|邹昌|王刚|杨成丽|胡杰|庄伟华|徐顺|胡文创

四川大学华西医院精准医学转化研究中心（PMTRC）实验室医学系，中国四川成都610041

摘要

DNA甲基化是一种关键的表观遗传修饰，也是早期癌症诊断和预后的重要生物标志物。本文报道了一种可视化生物传感方法，该方法将CRISPR/Cas12a系统与纳米酶催化的信号转导技术相结合，用于直接检测甲基化DNA。值得注意的是，具有过氧化物酶活性的Pd/NiFe层状双氢氧化物纳米酶通过单链DNA（ssDNA）连接剂固定在磁珠上，当Cas12a被甲基化DNA激活时，ssDNA的切割会触发纳米酶介导的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）的氧化，从而产生可见的颜色变化。该检测方法能够以0.5 pM的检测限高度灵敏地检测与肺癌相关的DNA甲基化，为表观遗传分析和更广泛的核酸诊断提供了一种有前景且可推广的策略。

引言

表观遗传改变是肿瘤发生过程中的最早分子事件之一，其中DNA甲基化是调控基因表达和基因组稳定性的关键机制[1]、[2]、[3]、[4]。异常的DNA甲基化模式，尤其是基因启动子区域的过度甲基化，与癌症的发生和发展密切相关，并逐渐被认可为早期癌症诊断和预后评估的宝贵生物标志物[5]、[6]。传统的甲基化分析方法，包括甲基化敏感的限制性内切酶PCR、液相色谱、质谱和亚硫酸盐测序，虽然具有强大的分析能力，但受到复杂仪器、高酸性或高温反应条件以及耗时工作流程的限制[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。这些限制使得这些方法仅能在设备齐全的实验室和受过专业培训的人员中使用，从而阻碍了其在快速和便捷的临床诊断中的应用。因此，迫切需要开发简单、灵敏且高度特异的DNA甲基化检测方法，以应用于转化医学和即时诊断。

最近，CRISPR-Cas系统的应用范围已从核酸[12]、[13]、[14]扩展到蛋白质[15]、[16]、[17]、[18]和小分子[19]、[20]，它们现在被研究作为DNA甲基化检测的强大工具[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。例如，李等人设计了一种带有纳米粒子稳定荧光信号的CRISPR-Cas12a系统，用于检测多种DNA甲基化标记[22]；田等人提出了一种基于CRISPR-Cas12a的系统，利用DNA酶和分裂适配体设计来可视化检测特定位点的DNA甲基化[24]。近年来，纳米酶因其卓越的催化性能、低合成成本和优异的稳定性[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]而受到越来越多的关注，使其成为生物标志物检测和疾病诊断的理想候选者[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。值得注意的是，具有过氧化物酶活性的纳米酶（POD）可以催化H?O?分解为羟基自由基（·OH），从而引发3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化为蓝色氧化产物TMB_ox[39]、[40]、[41]。研究表明，纳米酶可以与CRISPR系统结合实现无需预扩增的RNA检测[42]，并通过靶向基因激活来调节阿尔茨海默病中的氧化应激[43]。

在这项工作中，我们开发了一种纳米酶辅助的CRISPR/Cas12a系统，构建了一个用于DNA甲基化检测的可视化生物传感平台。具体来说，Pd/NiFe LDH纳米酶通过单链DNA（ssDNA）连接剂固定在磁珠表面。在没有目标DNA的情况下，纳米酶仍固定在磁珠上，可以通过磁分离方法将其去除。当上清液加入TMB体系时，仅观察到微弱的显色信号；而当识别到甲基化DNA目标时，Cas12a蛋白被激活并触发ssDNA连接剂的切割，导致纳米酶-磁珠复合物释放到溶液中。随后收集上清液进行过氧化氢-TMB反应，生成蓝色的TMB_ox。总体而言，该系统的信号转导途径包括目标识别-触发Cas12a激活、ssDNA切割和纳米酶释放，随后通过均匀催化增强显色信号（图1a）。这种检测方案能够在低至0.5 pM的浓度下实现直接检测，是一种有前景的表观遗传诊断技术。

部分内容摘要

Pd/NiFe LDH的制备

Pd/NiFe LDH通过水热合成后进行原位氧化还原沉积制备。将1.5 mmol Ni(NO?)?·6H?O、0.5 mmol Fe(NO?)?·9H?O、3 mmol NH?F和6 mmol尿素溶解在40 mL去离子水中，于120°C下水热处理5小时。所得到的NiFe LDH用去离子水洗涤并在60°C下干燥。随后，将0.1 g NiFe LDH浸入100 mL 1 mM K?PdCl?溶液中20分钟，自发氧化还原反应生成Pd/NiFe LDH，并将其收集起来。

表征

扫描电子显微镜（SEM）图像显示NiFe LDH具有典型的花状纳米片结构（图S1），经过Pd修饰后结构基本保持完整（图S2），表明其结构完整性得以保留。SEM及其对应的映射图像证实了Pd、Ni、Fe和O在纳米片表面的均匀分布（图S3）。透射电子显微镜（TEM）进一步显示NiFe LDH表面分布着许多纳米颗粒。

结论

总之，我们开发了一种纳米酶辅助的CRISPR/Cas12a平台，用于DNA甲基化的比色检测。具有过氧化物酶活性的Pd/NiFe LDH纳米酶能够通过可见的TMB氧化反应实现高效信号转导。当被甲基化DNA目标识别并激活时，Cas12a介导的ssDNA连接剂切割会释放纳米酶，催化显色底物，产生明显的信号响应。

CRediT作者贡献声明

王志通：撰写初稿、方法学设计、实验设计、概念构思。林佩文：撰写初稿、方法学设计、概念构思。严瑞仪：方法学设计、实验设计。姚永超：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。邹昌：软件开发、数据管理。王刚：软件开发。杨成丽：监督工作、软件支持。胡杰：监督工作、软件支持。庄伟华：方法学设计、数据管理。徐顺：撰写、审稿