《Molecular Nutrition & Food Research》：Tomato-Soy Juice Reduces Inflammation and Modulates the Urinary Metabolome in Adults With Obesity
番茄-大豆混合果汁在成人肥胖中的抗炎与代谢调节作用研究
1 引言
慢性、低度炎症是许多非传染性疾病的共同特征。富含番茄和大豆的饮食与炎症相关疾病的良好健康结局相关，其中番茄红素和大豆异黄酮分别被认为是关键的生物活性成分。基于整体食物组合可能比单一的植物化学物发挥更大效应的观点，本研究旨在比较番茄-大豆果汁与低类胡萝卜素番茄汁对照在肥胖个体中的抗炎和代谢效应。
炎症是机体免疫防御的重要机制，但其持续激活会通过促进氧化应激和组织损伤损害生理功能。肥胖是主要的公共卫生问题，也是心脑血管疾病和癌症等慢性疾病的风险因素。低度炎症同样是其他非传染性疾病的常见标志，其特征是白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β和C反应蛋白（CRP）等细胞因子处于高水平但处于亚临床水平。
饮食被认为是可调节的因素，与降低慢性疾病患病率相关。植物是植物化学物的主要来源，例如类胡萝卜素（如番茄中的红色素番茄红素）和黄酮类化合物。观察性研究表明，富含植物化学物的饮食可能预防肥胖、心脑血管疾病和癌症。在肥胖动物模型中，番茄红素补充剂已被证明可通过调节IκB磷酸化，抑制脂肪和肝组织中核因子κB（NF-κB）通路的关键促炎标志物。来自番茄（如柚皮素）和大豆（如染料木素）的膳食黄酮类化合物也通过抑制脂肪细胞中NF-κB和细胞外信号调节激酶（ERK）等转录因子和激酶的信号传导，表现出抗炎活性。
研究越来越强调整体饮食模式在塑造健康结局中的作用，因为人们消费的是完整的食物，而不是孤立的单个化合物。利用食物和植物化学物的组合进行干预，不仅反映了现实的饮食行为，还捕捉了可能影响其生物活性的分子间相互作用。在此背景下，我们关注番茄和大豆，这两种食物都与健康保护效应相关，尤其是在前列腺癌方面。流行病学研究引发了一系列针对前列腺癌补充番茄和大豆的调查研究。在前列腺癌小鼠模型中，有趣地发现，同时喂食富含番茄和大豆胚芽饲料的小鼠，比单独喂食大豆或番茄粉的小鼠更能预防前列腺癌的发生。这表明番茄和大豆联合使用时具有累加效应。为了在人体中测试这种协同作用，俄亥俄州立大学的研究人员开发了一种新型功能性食品——番茄-大豆果汁。
虽然番茄-大豆干预最初应用于前列腺癌，但更多有希望的证据表明，当单独或联合食用时，番茄和大豆可以影响与肥胖和其他慢性疾病相关的更广泛的炎症和代谢通路。考虑到癌症、肥胖和炎症共享的生物学通路，特别是涉及细胞因子信号传导和代谢的通路，人们对在其他炎症相关背景下探索番茄-大豆干预越来越感兴趣。
在本研究中，我们调查了摄入高番茄红素番茄-大豆果汁干预与低类胡萝卜素番茄汁对照相比，对肥胖个体的抗炎和代谢效应。对照组干预使用低类胡萝卜素番茄品种制成，旨在作为匹配的基质，帮助分离番茄红素和大豆的影响，同时控制非类胡萝卜素番茄植物化学物。为了捕捉对干预的系统性反应，我们测量了血液中的炎症细胞因子，并使用非靶向代谢组学方法分析了尿液代谢物。尿液分析提供了重要见解，因为它反映了每次干预后饮食来源和内源性代谢物的排泄，从而能够敏感地检测饮食摄入，以识别与番茄-大豆消费相关的代谢变化和特定植物化学物代谢物。通过研究炎症标志物和尿液代谢组谱，我们旨在揭示番茄-大豆消费后发生的分子特征和机制。
2 实验部分
2.1 受试者与实验设计
总计13名受试者开始了这项研究，其中1名因中间洗脱期的不依从性而退出。12名居住在马里兰州贝尔茨维尔地区的健康肥胖（体重指数30–45 kg/m2）男女参与者在美国农业部农业研究局下属的贝尔茨维尔人类营养研究中心完成了一项随机交叉试验。本研究在2019年3月至5月期间进行。受试者年龄在30-60岁之间，要求血浆总胆固醇水平≤250 mg/dL，甘油三酯水平≤250 mg/dL。排除标准包括吸烟、每日使用处方抗炎药、研究前3个月内使用抗生素、研究前1个月内使用类胡萝卜素/异黄酮/改变代谢的补充剂、存在自身免疫或代谢紊乱、存在任何胃肠道或吸收不良状况、提示肝脏或肾脏疾病，以及对番茄或大豆过敏。参与者的基线特征见表1。研究期间未报告不良事件。
为了测试番茄红素和异黄酮对炎症和代谢组的影响，要求受试者在干预前2周摄入低水平这些植物化学物的饮食。提供了咨询和应避免的食物清单以实现低番茄红素/异黄酮饮食。经过2周的洗脱期后，受试者被随机分配每天饮用360 mL（两罐180 mL）富含大豆的高番茄红素番茄（番茄-大豆）果汁或低类胡萝卜素的黄番茄汁（对照），持续4周。随后是4周的洗脱期（低番茄红素和异黄酮饮食），参与者开始第二个为期4周的干预，每天饮用另一种果汁。在干预的第0、2、6、10和14周收集参与者的空腹血样，离心后将血浆分装到冻存管中，于-80°C储存。在第2、6、10、14周收集受试者24小时尿样至含有10 g硼酸用于保存的4 L塑料罐中。然后将尿样分装成更小的等分试样并于-80°C储存。本研究经Chesapeake IRB批准，并在clinicaltrials.gov上注册为NCT03783013。所有参与受试者均提供了书面知情同意。
2.2 研究处理
本临床试验使用了在俄亥俄州立大学中北部农业研究站种植的两个番茄品种来制作果汁。对照番茄汁由OH8614制成，这是一种低类胡萝卜素的实验自交系杂交种，具有非功能的八氢番茄红素合酶，这是类胡萝卜素生物合成所必需的酶。番茄-大豆果汁使用了FG99-218，这是一种含有深绿（dg）和老黄金绯红（ogc）等位基因的高番茄红素自交系品种。这些番茄按照良好生产规范进行机械收获、分选完全成熟、去皮并在OSU食品工业中心进行热破碎加工成果汁。完全成熟的高番茄红素番茄在热破碎加工前，额外添加了从胚芽中提取的40%大豆异黄酮提取物Solgen 40S，加工成果汁。最终果汁产品含有盐以改善适口性。
2.3 化学品
实验使用了多种化学品和标准品，包括β-胡萝卜素、尿苷-5′-二磷酸葡萄糖醛酸（UDGPA）、氯化镁、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′-磷酸还原四钠盐水合物（NADPH）、Tris盐酸盐、4-乙基苯酚硫酸盐、4-乙基苯酚、二氢染料木素、酪醇等。番茄红素从番茄酱中提取结晶，光谱纯度测定为>98%。
2.4 干预果汁中植物化学物含量的测定
2.4.1 果汁中大豆异黄酮的提取和高效液相色谱-二极管阵列检测分析
对番茄-大豆和对照番茄汁中的大豆异黄酮含量进行了分析。使用60%乙腈提取果汁样品，经过超声和离心后，上清液转移至容量瓶，重复提取多次。提取物用氮气吹干，于-80°C储存直至使用高效液相色谱-二极管阵列检测分析。在配备Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱的Agilent 1260 HPLC-DAD系统上进行分析，使用水和0.1%甲酸（A）以及乙腈和0.1%甲酸（B）的梯度洗脱程序，对大豆苷元、染料木素、黄豆黄素及其糖苷形式进行定量。
2.4.2 果汁中类胡萝卜素的提取和高效液相色谱-二极管阵列检测分析
从番茄-大豆和对照果汁中提取类胡萝卜素，并使用HPLC-DAD进行分析。使用外标曲线对番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素和β-隐黄质进行定量。八氢番茄红素和六氢番茄红素通过各摩尔消光系数与番茄红素的比值创建相对斜率进行定量。
2.5 炎症生物标志物的评估
为了确定膳食番茄干预对系统性炎症的调节作用，测量了血浆中的炎症细胞因子。通过基于微珠的多重免疫测定法，由Eve Technologies公司对每个样品中的15种细胞因子进行复孔定量。
2.6 血液血浆类胡萝卜素的提取和分析
从血浆中提取类胡萝卜素，并使用与果汁分析相同的HPLC-DAD方法进行分析。
2.7 尿液代谢组谱分析
2.7.1 尿液样品制备
尿液解冻后离心，测量尿液渗透压。为考虑受试者间/时间点间尿量和 hydration 水平的差异，每个样品用水标准化至100毫渗量。将标准化尿样加入含有甲醇和乙腈的新样品管中，使最终混合物为注射溶剂（乙腈/甲醇/水=2:1:1），离心以沉淀不溶性物质。使用水按照相同步骤制备过程空白。通过汇集每个标准化尿样的等分试样制备质量控制样品。
样品在配备ESI离子源的1290 Infinity超高效液相色谱与6546四极杆飞行时间质谱联用系统上进行分析。为获得全面的代谢物覆盖，在每个样品的4种分析组合中收集数据：反相液相色谱-质谱正模式、反相液相色谱-质谱负模式、亲水相互作用液相色谱-质谱正模式和亲水相互作用液相色谱-质谱负模式。对于每次分析，样品顺序随机化，每第七个位置（约每1.5-2小时）插入质量控制样品以监测整个实验运行期间的仪器变异性。每次运行开始时排列三个过程空白，以说明提取材料的残留和污染，并将其从下游分析中去除。
对于反相液相色谱-质谱分析，将20 μL样品注入保持在40°C的Waters HSS色谱柱。流动相由含0.1%甲酸的水和含0.1%甲酸的乙腈组成，流速0.4 mL/min。在50-1700 m/z的质量范围内以3 spectra/sec的扫描速率获取全扫描数据。
亲水相互作用液相色谱分析的方法进行了调整。将20 μL样品注入保持在40°C的Waters Z-HILIC色谱柱。流动相由含10 mM甲酸铵和0.1%甲酸的乙腈/水溶液以及含10 mM甲酸铵和0.1%甲酸的乙腈/水溶液组成。以0.5 mL/min的流速应用14分钟梯度。质谱源参数设置为与反相液相色谱-质谱分析相同的参数。
2.8 数据分析
2.8.1 类胡萝卜素和炎症细胞因子的单变量统计分析
使用均值和标准差总结参与者的基线特征。最初使用线性混合效应模型研究血浆样品中类胡萝卜素水平和炎症蛋白的变化，以纳入交叉设计和干预顺序。测试了几个模型，包括性别和年龄等变量，以调整对结果的潜在影响。根据最低的校正Akaike信息准则选择最佳混合效应模型。最终，p< 0.05的类胡萝卜素和细胞因子被认为是统计学显著的。对于细胞因子数据中的缺失值，用每种蛋白质最低浓度的一半进行估算。
2.8.2 代谢组学数据预处理和统计分析
使用MZmine3将光谱数据转换为化学特征及其丰度的列表。从超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱分析获得的原始光谱数据文件使用ProteoWizard的MSConvert从Agilent .d文件转换为.mzML文件，并导入MZmine3进行数据去卷积。特征提取和对齐参数见表S1。在R v4.4.1中进行数据过滤和分析。为确保数据质量，每个代谢组学数据集中的特征根据以下标准进行过滤：必须存在于每个质量控制样品中，在质量控制样品中的变异系数必须小于30%，并且在质量控制样品中的强度必须至少比过程空白高10倍。用每个特征最低峰强度的一半替换缺失值。每个数据集在过滤和估算后进行log2转换。然后使用R中的notame包校正强度漂移，并使用同一包对相似特征进行聚类以减少冗余。使用主成分分析进行数据可视化。对所有代谢组学数据集应用单变量统计检验，并使用Benjamini-Hochberg程序进行多重检验校正。
2.8.3 代谢组学特征鉴定
在所有4种分析组合的汇集处理样品上进行数据依赖性和非依赖性超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱实验，以帮助鉴定特征。使用真实或生物合成的标准品，通过比较标准品的精确质量、保留时间和碎片模式与感兴趣的峰，进一步鉴定某些特征。鉴定化合物的质量详细列于表S2和S3。鉴定化合物的置信水平根据代谢组学标准倡议指南进行了调整。简而言之：1级是基于保留时间和m/z与真实标准品匹配而鉴定的化合物；1.5级是基于保留时间和m/z与生物合成标准品匹配而鉴定的化合物；2级鉴定化合物是基于与文献中发表的光谱图匹配；3级是化合物类别被鉴定；4级是未知。
2.8.4 体外生物合成
2.8.4.1 从标准品生物合成代谢物
为了确认葡萄糖醛酸化、磺化和氧化代谢物的鉴定，将猪肝S9组分和辅因子与前体标准品一起孵育。通过将10 μL标准溶液、10 μL S9肝酶和Tris盐酸盐缓冲液中的以下辅因子孵合来合成代谢物。样品干燥并重构在与尿液代谢组学分析相同的注射溶剂中。为了确认体外酶系统中合成的代谢物的存在，将生物合成样品、新鲜标准品和两个对照注入超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱系统。
2.8.4.2 从干预果汁生物合成代谢物
为了进一步验证饮食来源代谢物的注释，将相同的生物合成方法和液相色谱-质谱分析应用于干预果汁的水解提取物。将这些样品与生物合成代谢物、新鲜标准品和对照一起注入和分析。
对果汁提取物进行酸水解以模拟体内糖基化植物化学物的酶促水解。将甲醇中的3 N HCl添加到番茄-大豆或对照果汁中，超声处理并在70°C和70 RPM的摇动水浴中孵育4小时。水解提取物用3 N氢氧化铵中和并离心后，上清液过滤并分析提取离子流图中的目标质量。
2.9 数据集可用性
原始一级质谱数据可在Metabolomics Workbench获取，数据依赖的串联质谱数据已存放在GNPS的MassIVE中。代谢组学、类胡萝卜素和细胞因子分析的代码可在指定GitHub仓库找到。
3 结果与讨论
3.1 表征干预制剂有助于在实现跨研究比较的同时，建立生物活性化合物与健康效应之间的合理联系
本研究中提供的番茄-大豆果汁旨在提供与观察性研究中降低癌症风险相关的番茄红素和大豆异黄酮剂量。番茄-大豆和低类胡萝卜素番茄汁干预中单个类胡萝卜素和大豆异黄酮的含量列于表2，其中番茄红素是番茄-大豆中的主要类胡萝卜素，染料木苷是最丰富的大豆异黄酮。参与者每天从番茄-大豆果汁中摄入54 mg番茄红素和189.9 mg总异黄酮。八氢番茄红素和六氢番茄红素仅在番茄-大豆果汁中可定量，平均分别为每天12.6 mg和4.6 mg。
相比之下，由黄肉番茄制成的对照果汁含有非常低的类胡萝卜素水平。八氢番茄红素和六氢番茄红素水平太低，无法在对照番茄汁中定量。这些番茄携带一个特征明确的八氢番茄红素合酶非功能性等位基因。由于对照所用黄番茄中存在八氢番茄红素合酶突变，预计该果汁的类胡萝卜素水平非常低，正如观察到的。然而，这些类胡萝卜素并未完全缺失，因为番茄中类胡萝卜素的产生在果肉和果皮中独立控制，而该突变仅存在于果肉中。
为了将我们的番茄-大豆干预的暴露水平置于背景中，与典型的膳食摄入量和与健康益处相关的量进行比较是有用的。在美国饮食中，番茄红素摄入量通常根据流行病学证据范围约为3-15 mg/天。每天高达21 mg的番茄红素摄入量与前列腺癌风险呈负相关。一份标准份的番茄酱每份含有约10-17 mg，而本研究的参与者从番茄-大豆果汁干预中摄入了约54 mg番茄红素——超过了西方饮食中通常的消费量，并且与之前提供给前列腺癌受试者每天饮用2罐番茄-大豆果汁的量相当。此外，日本成年人通常每天摄入30-50 mg异黄酮，而西方人群的摄入量低于3 mg/天。癌症发病率，特别是乳腺癌，在东亚国家较低，这种差异通常归因于富含大豆的饮食。在本研究中，参与者平均每天接受189.9 mg总大豆异黄酮，其中约98%是糖苷。染料木苷占大多数异黄酮含量，平均为142.6 mg/天。先前的研究表明，从番茄-大豆果汁中摄取的类胡萝卜素和大豆异黄酮容易被吸收，达到与慢性疾病风险较低人群相当的水平。在后续干预中，同一研究组表明，前列腺癌患者每天饮用1罐或2罐番茄-大豆果汁，番茄红素和大豆异黄酮分别在血浆和尿液中引起剂量反应性增加。基于此证据，本研究中番茄-大豆干预的设计旨在最大化整个食品产品中共同给药的番茄红素和大豆异黄酮成分的含量。通过表征干预果汁的植物化学组成，我们为理解本研究中观察到的代谢和生理效应奠定了基础，同时促进了跨文献的有意义的比较。
3.2 仅在受试者摄入番茄-大豆果汁后，血液血浆中的类胡萝卜素显著增加
为了研究血液血浆类胡萝卜素水平的变化，首先应用了线性混合效应模型。没有由先前干预引起的序列残留效应，性别和年龄对类胡萝卜素水平没有贡献。因此，使用配对Student t检验来确定显著变化。总番茄红素和β-胡萝卜素水平在摄入番茄-大豆后血液中整体显著增加，而同一受试者在对照干预期间大多显示未变化或降低的水平。只有一名受试者在对照干预后表现出总番茄红素水平增加，表明不依从，因此在进行前后对照和后对照与后番茄-大豆比较时，从下游分析中排除了该受试者。在基线时，我们观察到受试者的血浆β-胡萝卜素和番茄红素分别约为450 ± 293 和 950 ± 380 nmol/L。这与美国人典型的血浆类胡萝卜素水平一致，平均约为300 nmol/L β-胡萝卜素和800 nmol/L番茄红素。
鉴于番茄红素是番茄-大豆果汁中的主要类胡萝卜素，预计它将是干预后血液血浆中测量到的最丰富的类胡萝卜素。我们发现，摄入番茄-大豆果汁后，番茄红素水平达到1298.4 (± 664.71) nmol/L，平均比干预前增加了2.82倍。所有受试者在摄入番茄-大豆后循环番茄红素均增加。当受试者摄入低类胡萝卜素对照时，番茄红素水平没有显著变化，但排除了离群受试者后，数值上下降了约7%。血浆番茄红素在番茄-大豆干预结束时显著高于后对照果汁。摄入番茄-大豆后，β-胡萝卜素也观察到相似的趋势。血浆β-胡萝卜素水平显著增加至662.1 (± 347.95) nmol/L，与前番茄-大豆相比平均增加了2倍。摄入对照果汁后，β-胡萝卜素水平与前相比显著下降了约15%。到番茄-大豆干预结束时，血浆β-胡萝卜素水平显著高于后对照果汁。此外，六氢番茄红素水平在番茄-大豆后从约200 nmol/L显著增加至350 nmol/L，而在对照后从975 nmol/L显著下降至约240 nmol/L。血液中定量的其余类胡萝卜素在两种干预中均未发生变化。
我们报告的后番茄-大豆干预水平与先前报道的番茄基干预一致，在每日摄入后，血浆番茄红素浓度通常超过1000 nmol/L。本研究中达到的
