产前联合暴露于空气污染与母体应激对小鼠社交行为及催产素/加压素系统的性别特异性影响

本文深入探讨了产前共同暴露于柴油机尾气颗粒物（DEP）与母体应激（MS）对后代神经发育的深远影响。研究表明，这种联合暴露不仅导致雄性后代出现社交互动缺陷，更首次在雌性后代中观察到社会新颖性偏好受损，这提示雌性小鼠的社交行为可能受到比以往认识更显著的影响。在机制层面，研究发现DEP/MS暴露并未改变下丘脑催产素（OXT）和加压素（AVP）神经元及其纤维的表达，但显著上调了两性伏隔核中加压素1a受体（V1aR）的mRNA水平。这些发现为理解环境压力与毒性物质如何协同干扰社会行为关键神经回路提供了新视角，并对评估类似暴露在神经发育障碍（如自闭症谱系障碍）风险中的作用具有重要价值。

　　

引言

空气污染是全球性的重大公共卫生负担，超过73亿人暴露于不安全的空气污染水平。同时，空气污染对低收入社区的影响尤为严重，这些社区通常也面临更高的社会心理压力和更低的资源可用性。产前暴露于空气污染和母体心理社会压力，均是自闭症谱系障碍（ASD）等神经发育障碍的风险因素。虽然50%–80%的自闭症风险可归因于遗传因素，但仍有相当一部分风险由环境暴露驱动。累积性的发育暴露于空气污染和心理社会压力可能产生叠加效应。例如，有研究发现，生命第一年暴露于PM_2.5与ASD风险增加相关，且这种关联受社区剥夺指数的影响。同样，母体感知压力与5-7岁儿童海马体积减少和视觉空间推理能力下降相关，而这种关系又受产前多环芳烃（空气污染的一种成分）暴露的调节。现有文献表明，产前暴露于空气污染和母体心理社会压力可能相互作用，改变神经发育轨迹，从而增加神经发育和/或精神疾病的风险。

动物模型为理解产前毒物和/或母体应激（MS）暴露后神经发育紊乱的神经生物学机制提供了进一步的见解。几项使用啮齿动物模型的研究观察到，在生命早期发育阶段暴露于空气污染和/或MS会导致后代社交行为改变。在人类中，社交行为紊乱是ASD的核心症状。在子宫内通过母体免疫激活（MIA）间接影响后代，与出生后直接暴露于空气污染有根本不同。一系列使用小鼠模型的研究发现，在妊娠期联合暴露于柴油机尾气颗粒（DEP）和MS，会导致后代出现雄性偏向的社交缺陷。重要的是，单独的产前空气污染或MS暴露均未观察到社交能力和社交新颖性偏好的缺陷，这表明对母亲施加应激源暴露了其对环境毒物的脆弱性，这与人类文献的发现一致。然而，哪些社会行为回路在DEP/MS暴露后受到干扰仍不清楚。

社会决策网络（SDMN）是一组相互连接的大脑区域，对产生社会行为至关重要，包括伏隔核（NAc）、外侧隔核（LS）、海马和杏仁核（AMY）等脑区。催产素（OXT）和加压素（AVP）是跨物种社会行为的关键神经肽调节剂。OXT信号参与多种行为，包括母性行为、繁殖行为、社会调查和识别、社会新颖性寻求、社会回避、合作行为和社会游戏，通常具有性别特异性效应。同时，AVP信号调节攻击性、社会识别、合作行为、伴侣偏好、社会交流、社会游戏、社会调查等。OXT和AVP主要在下丘脑核团合成，最重要的是下丘脑室旁核（PVN）和视上核（SON），也在扩展的AMY中合成。重要的是，OXT和AVP纤维及其各自的受体——催产素受体（Oxtr）和加压素V_1a受体（V_1aR）——在整个SDMN区域都有丰富的表达。

尽管有大量文献研究围产期环境毒物暴露对OXT和AVP系统的影响，特别是塑料、阻燃剂和杀虫剂，但关于围产期空气污染物对啮齿动物模型中OXT、AVP及其各自受体影响的研究很少。DEP/MS会诱导MIA，而几项使用MIA模型的研究发现了OXT、Oxtr和AVP的变化。同样，对妊娠期MS的研究发现，雄性后代前额叶皮层中OxtrmRNA表达减少。然而，空气污染和MS联合暴露如何影响大脑中OXT和AVP细胞及受体表达尚不清楚。

本研究旨在评估产前DEP/MS暴露对社交行为、下丘脑中OXT和AVP细胞及其投射、以及SDMN区域内Oxtr和Avpr1amRNA表达的影响，并与VEH/CON对照组在雄性和雌性后代中进行比较。具体来说，我们测量了PVN、外侧下丘脑（LH）、前下丘脑（AH）和内侧视前区（MPOA）内的OXT免疫反应性（-ir）和AVP-ir细胞数量和纤维密度。我们评估了DEP/MS暴露后雄性和雌性后代在NAc、LS、AMY、背侧海马（dHipp）和腹侧海马（vHipp）中Oxtr和Avpr1amRNA的表达。由于我们之前的工作只发现联合DEP/MS暴露导致社交缺陷，而单独的DEP或MS暴露则没有，因此本研究只包括VEH/CON和DEP/MS组。基于先前在该模型中报告雄性特异性社交行为减少的工作，我们假设DEP/MS会降低雄性后代许多这些区域中OXT和/或AVP系统参数的表达，这与社交缺陷相对应。

方法

动物与暴露

使用野生型C57Bl/6J小鼠。从妊娠第2天（E2）开始，孕鼠每3天接受一次DEP（50 μg/50 μL）或 Vehicle（VEH）的口咽滴注，共6次。从E13开始，接受DEP滴注的孕鼠被单独饲养在铺有薄层AlphaDri垫料并放置抬高的铝网平台（MS条件）的笼中，并获得2/3个棉筑巢材料。接受VEH滴注的孕鼠则被置于有AlphaDri垫料和完整筑巢材料（CON条件）的笼中。在E17.5（分娩前一晚），所有孕鼠被转移至装有干净AlphaDri垫料和完整筑巢材料的新笼子。

行为测试

在后代青春期（P25–P37）进行一系列行为测试。包括明暗箱测试、三箱社交能力测试和三箱社交新颖性偏好测试。所有测试均由不知情的观察者使用Solomon Coder进行评分。

免疫组化

在P42-44，对小鼠进行灌流取脑。使用免疫荧光染色法标记下丘脑（PVN、LH、AH、MPOA）中的OXT-ir和AVP-ir细胞及纤维，并在显微镜下成像，使用FIJI软件进行手动计数和面积百分比分析。

定量PCR

在P50-52，从未进行行为测试的另一组小鼠中取脑。使用打孔法获取NAc、LS、AMY、dHipp和vHipp的脑组织。提取RNA后，通过定量PCR（qPCR）检测Oxtr和Avpr1a的mRNA表达水平，使用2^-ΔΔCT法进行相对定量分析。

统计

使用GraphPad Prism 10进行统计分析。数据正态性检验后，根据情况使用双向方差分析（ANOVA）、混合效应模型或非参数检验（如Mann-Whitney U检验）。显著性水平设为p< 0.05。

结果

母体和窝产结果

DEP/MS暴露不影响孕鼠妊娠期的体重增加、窝产仔数或每窝中雄性和雌性幼崽的数量。然而，在P16时，DEP/MS雄性幼崽的体重低于VEH/CON雄性，而雌性幼崽的体重没有差异。在P40时，DEP/MS雄性与VEH/CON雄性的体重没有差异，但DEP/MS雌性的体重大于VEH/CON雌性。

行为结果

1. 1.
   明暗箱测试：在雄性中，DEP/MS没有改变在各区域的停留时间或粪便颗粒沉积。在雌性中，存在处理×区域的交互作用，DEP/MS雌性在明室停留时间有增加趋势，在暗室停留时间有减少趋势，而VEH/CON雌性则明显偏爱暗室。
2. 2.
   社交能力测试：在雄性中，DEP/MS降低了总的刺激互动时间，这主要是由刺激攀爬时间的减少驱动的，而非鼻子探查时间。两组都花了更多时间在含有社会刺激的箱室。在雌性中，DEP/MS对互动、鼻子探查或攀爬没有影响。所有雌性都花了更多时间探查社会刺激，并更偏爱社会刺激箱室。
3. 3.
   社交新颖性偏好测试：在雄性中，DEP/MS对互动时间没有影响，但趋向于减少刺激攀爬时间。在雌性中，DEP/MS导致与陌生同类互动时间和鼻子探查时间显著减少，并且更偏爱熟悉笼伴所在的箱室，而减少在陌生同类箱室的停留时间。

下丘脑OXT和AVP表达

1. 1.
   PVN和AH中的细胞体：在更靠吻侧的PVN Level 1亚区，DEP/MS倾向于增加OXT-ir细胞数量（主效应，p= 0.07）。在更靠尾侧的PVN Level 2亚区，未观察到处理效应。在两个水平的PVN中，均未观察到DEP/MS或性别对AVP-ir细胞数量的显著影响。在AH中，DEP/MS对OXT-ir或AVP-ir细胞数量也没有影响。
2. 2.
   LH、AH和MPOA中的纤维：在LH、AH和MPOA中，无论是通过纤维计数还是面积百分比分析，均未观察到DEP/MS或性别对OXT-ir或AVP-ir纤维密度的显著影响。

Oxtr和Avpr1a在SDMN区域的基因表达

1. 1.
   伏隔核（NAc）：雄性表达比雌性更多的OxtrmRNA。DEP/MS增加了两性NAc中Avpr1amRNA的表达。
2. 2.
   外侧隔核（LS）：雌性表达比雄性更多的Oxtr和Avpr1amRNA。DEP/MS没有影响。
3. 3.
   杏仁核（AMY）：性别或处理对OxtrmRNA表达无显著影响。雌性表达比雄性更多的Avpr1amRNA。
4. 4.
   背侧海马（dHipp）：处理或性别不影响OxtrmRNA表达。DEP/MS趋向于增加两性dHipp中Avpr1amRNA的表达，且雌性趋向于表达比雄性更多的Avpr1amRNA。
5. 5.
   腹侧海马（vHipp）：处理或性别对Oxtr或Avpr1amRNA表达无影响。

讨论

本研究的结果表明了几个重要发现。首先，与之前的工作一致，DEP/MS暴露不会改变妊娠期母体体重增加或总体窝产组成，但似乎会轻微影响后代在出生后早期的体重增加。其次，与我们对DEP/MS后出现雄性特异性表型的假设相反，我们观察到DEP/MS暴露对雄性和雌性后代行为的影响，但每种性别受影响的具体行为结果不同。最后，虽然DEP/MS暴露似乎没有显著影响下丘脑中OXT-ir或AVP-ir细胞或纤维密度，但我们的结果表明，DEP/MS暴露可能改变Avpr1amRNA而非OxtrmRNA的表达：它增加了NAc中的Avpr1amRNA表达，并趋向于增加dHipp中的表达。

DEP/MS暴露对雄性和雌性社交行为的不同影响

我们评估了DEP/MS暴露对雄性和雌性后代青春期几种行为测试的影响。有趣的是，我们观察到DEP/MS暴露对两性行为都有影响，尽管受影响的具体行为结果在雄性和雌性之间有所不同。在社交能力测试中，暴露于DEP/MS的雄性比VEH/CON对照组花费更少的总体互动时间和刺激攀爬时间，并且在社交新颖性偏好测试中趋向于花费更少的刺激攀爬时间。另一方面，暴露于DEP/MS的雌性在社交新颖性偏好测试中表现出对社会偏好的转变，更偏爱熟悉的笼伴，表现为与VEH/CON雌性相比，与陌生同类的互动、鼻子探查和箱室停留时间减少。

我们在雄性社交能力测试中的发现与之前的工作仅部分一致。我们确实观察到DEP/MS后雄性后代互动时间减少，但这并非特异地针对社交互动。此外，我们发现总互动时间的减少主要是由刺激攀爬的减少驱动的，而非鼻子探查。这些发现可能反映了比之前报道的更普遍的探索行为减少。DEP/MS暴露后观察到的攀爬行为减少可能反映了探索动机或复杂运动能力的变化，这应是未来研究的主题。

与我们关于会看到雄性特异性社交缺陷的假设相反，在这里，我们发现DEP/MS暴露后雌性后代的社交新颖性偏好降低。由于本测试使用笼伴作为熟悉的同类，且被试是直接从与这个同类的共居状态进入测试的，这种转变很可能反映了与陌生同类互动的动机降低，而非社交记忆缺陷。然而，我们不能最终排除这种可能性。

DEP/MS暴露对OXT和AVP系统的影响

与我们的假设相反，DEP/MS暴露并没有减少下丘脑中OXT或AVP的表达。实际上，在PVN的吻侧部分，OXT-ir细胞数量有增加的趋势。这可能是对DEP/MS暴露的一种代偿反应。先前关于MIA模型的研究结果不一，有报告OXT增加、减少或无变化，这突显了暴露类型、时间和分析方法的重要性。

尽管细胞体和纤维密度没有变化，但我们发现NAc中Avpr1amRNA表达显著增加，并且dHipp中有增加趋势。V_1aR在社会行为、焦虑、学习和记忆中发挥作用。在NAc中，V_1aR信号传导调节社会奖励、社会攻击和社会偏好。在dHipp中，V_1aR参与社会识别记忆和社会攻击。因此，DEP/MS暴露后这些脑区V_1aR表达的增加可能与社会行为的变化有关。然而，需要进一步的研究来明确V_1aR表达变化与观察到的行为表型之间的因果关系。

局限性与未来方向

本研究存在一些局限性。首先，我们只检测了基因表达，而不是蛋白质水平或受体结合。其次，我们只研究了青春期行为，而DEP/MS的影响可能在生命不同阶段有所不同。第三，我们使用了合并的社交互动测量方法，未来研究应解析更细致的社会行为组成部分。最后，我们只检查了选定的脑区，DEP/MS可能影响其他涉及OXT/AVP信号传导的区域。

结论

总之，本研究表明，产前联合暴露于DEP和MS会以性别特异性的方式影响后代的社会行为，其中雌性对社会新颖性的偏好受损是一个新发现。在机制上，这种暴露特异性地上调了社会行为关键脑区（如伏隔核）中加压素V_1a受体的基因表达，而未改变催产素和加压素神经元本身的表达。这些发现强调了在评估环境风险因素对神经发育影响时考虑性别差异和多种压力源协同作用的重要性，并为理解相关神经精神障碍的环境病因提供了新的线索。