bZIP63.5转录因子通过调控锌指蛋白解毒网络增强哈茨木霉对链格孢菌的生物防治效力

《Microbial Biotechnology》：bZIP63.5 Regulates a Zinc-Finger Mediated Detoxification Network in Trichoderma Harzianum for Enhanced Biocontrol of Alternaria alternata

本研究首次在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)中揭示了bZIP转录因子bZIP63.5在抵御链格孢菌(Alternaria alternata)胁迫中的核心调控作用。通过构建过表达和敲低株系，证实bZIP63.5能显著增强木霉的直接拮抗、挥发性有机化合物(VOCs)和代谢物抑菌能力。研究进一步阐明了bZIP63.5识别已知顺式作用元件(TGTCACA, TGTCA, GTGA, TGAC)及新基序(TACGGAC)的DNA结合特性，并通过酵母双杂交鉴定其与组蛋白H4、热激蛋白HSP70等的相互作用。转录组和ChIP-PCR分析揭示，bZIP63.5通过直接上调一系列锌指转录因子(TFs)(如Zn2Cys6ZF56.5, C2H2ZF36.8等)，进而激活下游解毒基因(如ABC转运蛋白、细胞色素P450)和防御相关酶(如糖苷水解酶、过氧化物酶)，形成级联调控网络。功能验证表明，三个核心锌指TF对增强木霉的生防效力至关重要。该工作为解析真菌生防分子机制和开发林业病害新型防控策略提供了新见解。

　　

bZIP63.5转录因子在哈茨木霉抵御链格孢菌胁迫中的调控机制研究

1 引言

丝状真菌碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper, bZIP)转录因子(transcription factors, TFs)在调控多种真菌的生长、发育、胁迫响应和次级代谢中起着关键作用。例如，在稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)中，MoBzip10对于附着胞功能和侵染性生长至关重要；而在水稻稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)中，UvbZIP6调控氧化胁迫耐受性。木霉属(Trichoderma)真菌是应用最广泛的生防真菌之一，通过重寄生、竞争和诱导宿主抗性等多种机制有效抑制植物病原菌。然而，尽管bZIP转录因子在真菌胁迫响应和代谢中的作用已被广泛认知，其在木霉生防机制，特别是针对叶部病原菌过程中的具体功能仍知之甚少。链格孢菌(Alternaria alternata)是引起杨树黑斑病的病原菌，对林业和农业系统构成重大威胁。虽然一些木霉菌株对链格孢菌表现出抑制活性，但其背后的转录调控机制在很大程度上仍是未知的。本研究旨在阐明bZIP转录因子在哈茨木霉(Trichoderma harzianum) Tha739菌株拮抗链格孢菌过程中的作用。

2 材料与方法

本研究使用的哈茨木霉Tha739菌株分离自中国辽宁省葫芦岛市苹果叶片组织，并保藏于中国普通微生物菌种保藏中心。链格孢菌Aal004菌株由沈阳农业大学林学院提供。通过PEG介导的原生质体转化，构建了bZIP63.5的过表达株系(Tha-OE, Tha-FLAG)和基因沉默株系(Tha-IN)。利用对峙培养、挥发性有机化合物(volatile organic compounds, VOCs)和分泌代谢物抑制试验评估了转化子的抗真菌效果。采用以转录因子为中心的酵母单杂交(yeast one-hybrid, Y1H)和电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)鉴定了bZIP63.5结合的顺式作用元件(cis-acting elements)。利用酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)筛选了与bZIP63.5相互作用的蛋白。通过对野生型(Tha-WT)和bZIP63.5过表达株(Tha-OE)进行RNA测序(RNA-seq)和染色质免疫沉淀PCR(chromatin immunoprecipitation PCR, ChIP-PCR)，解析了bZIP63.5的下游调控网络。此外，构建并功能验证了三个核心锌指转录因子(Zn₂Cys₆ZF56.5, C₂H₂ZF36.8, C₂H₂ZF40.8)的过表达和敲除株系。

3 结果

3.1 哈茨木霉bZIP基因的全基因组鉴定及其胁迫响应性表达

在哈茨木霉Tha739基因组中鉴定出32个bZIP基因，命名为bZIP20.6至bZIP67.2。生物信息学预测显示所有bZIP蛋白均定位于细胞核。在50%链格孢菌发酵液胁迫下，通过实时定量PCR(real time-quantitative PCR, RT-qPCR)分析了这些基因的表达响应。结果表明，bZIP63.5在胁迫下表现出最强烈的上调表达，在处理12、24和48小时分别上调了3.58、12.55和3.71倍，因而被选为后续研究的核心候选基因。

3.2 ThabZIP63.5转化子的构建及其生防能力研究

成功构建了bZIP63.5的过表达株(Tha-OE)和基因沉默株(Tha-IN)。对峙培养试验显示，与野生型(Tha-WT)相比，过表达株Tha-OE1和Tha-OE3对链格孢菌的抑制率分别增加了50.48%和20.60%，而沉默株的抑制率则下降，表明bZIP63.5正向调控木霉的直接拮抗活性。在挥发性有机化合物(VOCs)抑制试验中，过表达株也表现出显著更强的抑制效果(抑制率分别增加51.17%和41.79%)，证实了bZIP63.5在调控VOCs介导的抑菌作用中的角色。

3.3 鉴定bZIP63.5结合的顺式作用元件

通过酵母单杂交(Y1H)筛选，鉴定出bZIP63.5结合的两段DNA序列：GTGTGACATA和TACGGAC。序列GTGTGACATA被预测包含四个已知的顺式作用元件核心：TGTCACA、TGTCA、GTGA和TGAC。而序列TACGGAC未匹配任何已知元件，被确定为一个新的结合位点，命名为BRS。通过系统的碱基截断实验，进一步将BRS的核心结合序列精确定位为四个最小功能核心：“⁵TACG³”、“⁵ACGG³”、“⁵CGGA³”和“⁵GGAC³”。电泳迁移率变动分析(EMSA)进一步在生化水平证实了bZIP63.5重组蛋白能够直接且特异地与这四个核心序列探针结合。

3.4 bZIP63.5调控下游基因的相互作用蛋白初探

酵母双杂交(Y2H)实验表明，bZIP63.5是一个转录激活子，其转录激活域位于N端(51-100位氨基酸)和C端(388-488位氨基酸)。在去除自激活区域后，筛选并初步验证了五个与bZIP63.5相互作用的蛋白，包括另一个bZIP转录因子bZIP45.3、一个接头蛋白(adapter protein)、组蛋白H4(histone H4)、热激蛋白HSP70(heat shock protein HSP70)以及一个功能未知的蛋白。这些发现提示bZIP63.5可能通过形成蛋白复合物来行使功能，并与染色质调控和胁迫响应过程相关联。

3.5 转录组分析揭示bZIP63.5调控防御相关基因的级联网络

比较野生型(Tha-WT)和bZIP63.5过表达株(Tha-OE)的转录组，发现在链格孢菌胁迫下，Tha-OE中有1181个基因表达发生显著差异。其中，6个显著上调的转录因子全部为锌指转录因子，包括4个Zn₂Cys₆型和2个C₂H₂型。ChIP-PCR结果证实，Zn₂Cys₆ZF56.5、C₂H₂ZF36.8和C₂H₂ZF40.8是bZIP63.5的直接下游靶标。此外，bZIP63.5还直接或间接调控了一系列解毒基因和防御相关基因。解毒基因包括细胞色素P450(cytochrome P450, CYP)基因、ABC转运蛋白(ABC transporters)基因、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase, FAH)基因、短链脱氢酶(short chain dehydrogenase, SDR)基因等。防御相关基因则包括糖苷水解酶(glycosyl hydrolases, GH)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、AMP结合酶(AMP-binding enzyme, AMP)和CFEM结构域基因等。

3.6 bZIP63.5介导的生防通路中核心锌指转录因子的功能验证

选择三个受bZIP63.5直接调控的核心锌指转录因子(Zn₂Cys₆ZF56.5, C₂H₂ZF36.8, C₂H₂ZF40.8)进行功能表征。构建了它们的过表达(OE)和敲除(KN)菌株。生物学特性测定发现，过表达株ThaZF56.5OE和ThaZF36.8OE的孢子产量分别比野生型提高了1.90倍和1.86倍。生防能力评估显示，在对峙培养中，三个锌指转录因子的过表达株均能增强对链格孢菌的抑制能力，其中ThaZF36.8OE和ThaZF40.8OE效果最为明显。在发酵液抑制试验中，ThaZF56.5OE和ThaZF36.8OE的发酵液抑菌率较野生型分别提高了42.83%和41.25%。在挥发性有机化合物(VOCs)抑菌实验中，所有过表达菌株产生的VOCs对病原菌的抑制率也显著高于野生型。这些结果有力地证明了这三个锌指转录因子在bZIP63.5介导的生防级联通路中扮演着关键的执行者角色。

4 讨论

本研究确立了bZIP63.5作为增强哈茨木霉对链格孢菌生防效力的关键转录调节因子。bZIP63.5在病原菌代谢物胁迫下的显著上调及其带来的抗真菌活性提升，与bZIP转录因子在真菌胁迫响应中的已知作用一致，但本研究首次在生防体系中系统阐明了其功能。研究发现bZIP63.5能结合已知的TGTCACA、TGTCA、GTGA、TGAC元件以及全新的TACGGAC基序，扩展了对其DNA结合特性的认知。与组蛋白H4和HSP70等蛋白的相互作用，提示bZIP63.5可能通过招募染色质重塑因子和协调胁迫响应来行使功能。本研究的核心发现是揭示了一个以bZIP63.5为顶端调节子的级联转录网络：bZIP63.5直接激活下游的锌指转录因子，后者进一步调控大量的解毒基因(如ABC转运蛋白、CYP450)和防御基因(如糖苷水解酶、过氧化物酶)，从而协同增强木霉的生防能力。这种多层次调控机制可能与木霉在复杂环境中有效抵御病原菌的适应性有关。对三个核心锌指转录因子的功能验证，不仅证实了该通路的生物学重要性，也为通过基因工程手段改良生防菌株提供了具体靶点。

5 结论

本研究系统阐明了bZIP转录因子bZIP63.5在增强哈茨木霉Tha739菌株对杨树黑斑病原菌链格孢菌生防能力中的作用。研究发现bZIP63.5在病原胁迫下被强烈诱导表达，并通过直接拮抗、挥发性有机化合物产生和解毒基因表达等多种途径正向调控抗真菌活性。该转录因子包含两个转录激活域，并能与bZIP45.3、接头蛋白、组蛋白H4、热激蛋白HSP70等多种蛋白相互作用。在分子机制上，bZIP63.5能够识别已知及新型顺式作用元件，并直接调控一个由锌指转录因子(Zn₂Cys₆和C₂H₂型)介导的级联防御网络，进而激活下游的ABC转运蛋白、细胞色素P450基因、抗氧化酶等一系列解毒与防御相关基因。该研究首次全面解析了木霉中bZIP介导的防御调控机制，为发展基于真菌的林业病害高效生防策略提供了新的理论依据和潜在的遗传改良靶点。