靶向PTEN缺失癌症的新机遇：p-PI3KβY962作为可成药靶点与生物标志物的发现

《Cancer Discovery》：A new antibody against p-PI3KβY962 reveals p-PI3KβY962... Open Access

本文报道了一项突破性研究，揭示了PTEN缺失肿瘤中一个关键的、可靶向的新机制。研究发现，PTEN作为酪氨酸磷酸酶，在正常情况下可去磷酸化PI3Kβ的Y962位点。当PTEN缺失时，p-PI3KβY962水平升高，与EPHA2、SRC形成复合物，驱动pERK/c-MYC和pAKT致癌信号通路。研究者不仅开发了特异性检测p-PI3KβY962的抗体，证实了其作为PTEN缺失癌症生物标志物的潜力，还发现FDA已批准药物达沙替尼（Dasatinib）可有效抑制p-PI3KβY962并显著抑制PTEN缺失肿瘤的生长。这项研究为开发针对PTEN缺失癌症的精准疗法指明了新方向。

在癌症研究中，PTEN（Phosphatase and tensin homolog）肿瘤抑制基因的缺失是驱动肿瘤进展和治疗耐药的关键因素，然而针对PTEN缺失肿瘤的有效靶向疗法一直缺位。本研究揭示了一个以前未知的、可成药的机制：PTEN缺失会上调PI3Kβ（磷脂酰肌醇3-激酶β催化亚基）的酪氨酸磷酸化，从而驱动肿瘤发生。

BioID蛋白互作谱分析揭示PTEN缺失诱导癌细胞中PI3Kβ–EPHA2相互作用

为了探究在PTEN缺失背景下PI3Kα和/或PI3Kβ是否形成新的相互作用，研究团队在PTEN缺失的乳腺癌细胞系中进行了BioID邻近标记分析。有趣的是，PI3Kα和PI3Kβ在这些PTEN缺失的三阴性乳腺癌（TNBC）细胞中显示出不同的相互作用组。在两种PTEN缺失细胞系中均与PI3Kβ选择性相关的四个互作因子中，EPHA2脱颖而出，其丰度最高，并且是与PI3Kβ在质膜上共定位的唯一因子。进一步的免疫共沉淀（Co-IP）分析验证了在PTEN缺失的细胞中，内源性EPHA2与PI3Kβ（而非PI3Kα）存在相互作用。研究还发现，在PTEN野生型细胞中，EPHA2与两种PI3K亚型的相互作用相当，但PTEN的敲除显著增强了EPHA2–PI3Kβ的相互作用，同时减弱了EPHA2–PI3Kα的相互作用。反之，在PTEN缺失细胞中恢复PTEN表达则显著削弱了EPHA2和PI3Kβ的相互作用。这些结果表明，PTEN缺失特异性地促进了EPHA2与PI3Kβ之间更强的相互作用。

PTEN作为蛋白酪氨酸磷酸酶通过去磷酸化PI3Kβ的酪氨酸-962位点调控PI3Kβ–EPHA2相互作用

接下来，研究团队探究了PTEN缺失增强PI3Kβ–EPHA2相互作用的机制。除了其众所周知的将PIP3转化为PIP2的脂质磷酸酶活性外，PTEN还具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。研究发现，与PTEN野生型细胞相比，PTEN敲除细胞中免疫沉淀的PI3Kβ（而非PI3Kα）的磷酸酪氨酸水平显著增加。在PTEN缺失的癌细胞系中重新表达PTEN野生型或其脂质磷酸酶活性缺陷突变体（G129E）可显著降低PI3Kβ上的磷酸酪氨酸水平，而蛋白磷酸酶活性缺陷突变体（Y138L）或双功能缺陷突变体（C124S）则几乎没有影响。这些结果表明，PTEN通过其蛋白磷酸酶活性来调控PI3Kβ的酪氨酸磷酸化。此外，Co-IP显示PTEN与PI3Kβ相互作用，并且底物捕获突变体PTEN-C124S与PI3Kβ的结合明显强于PTEN野生型，支持PI3Kβ是PTEN真正的生理底物。一致地，在PTEN缺失细胞中表达PTEN野生型或G129E突变体显著降低了PI3Kβ–EPHA2的相互作用，而Y138L或C124S突变体则没有。这些结果表明PTEN作为一种蛋白磷酸酶，调节PI3Kβ磷酸化及其与EPHA2的相互作用。

为了确定PTEN调控PI3Kβ的哪个磷酸化位点，研究团队从PTEN敲除细胞中表达并纯化了Flag标记的PI3Kβ进行LC-MS/MS分析。该分析检测到PI3Kβ上酪氨酸962（Y962）和苏氨酸930（T930）的磷酸化，这两个位点在多个物种中高度保守。在无细胞去磷酸化实验中，PTEN野生型和G129E突变体（缺乏脂质磷酸酶活性但保留蛋白磷酸酶功能）能有效去磷酸化含有磷酸化Y962的合成PI3Kβ肽段，而蛋白磷酸酶缺陷突变体Y138L和C124S则不能。值得注意的是，所有PTEN变体均不能去磷酸化含有pT930的肽段，表明PTEN作为酪氨酸磷酸酶靶向PI3Kβ的Y962位点。

为了研究PI3Kβ在这些位点的磷酸化是否影响其与EPHA2的相互作用，研究团队构建了模拟非磷酸化（T930A, Y962F, T930A/Y962F）或磷酸化（T930E, Y962E, T930E/Y962E）状态的PI3Kβ突变体。在PTEN缺失细胞中，与PI3Kβ野生型相比，Y962F和T930A/Y962F突变体显著削弱了与EPHA2的相互作用，而单独的T930A突变没有影响。相反，在PTEN野生型细胞中，表达磷酸模拟突变体T930E或T930E/Y962E增强了PI3Kβ–EPHA2的相互作用。免疫荧光染色显示，磷酸模拟突变体PI3Kβ-Y962E主要定位于质膜并与EPHA2共定位，而非磷酸化突变体PI3Kβ-Y962F则主要位于细胞质。这些结果支持PI3Kβ-Y962磷酸化增强了其与EPHA2的相互作用，并促进了PI3Kβ在PTEN缺失细胞中的膜定位。

持续的PI3Kβ磷酸化支持PTEN缺失肿瘤的生长

为了评估PTEN缺失诱导的PI3Kβ酪氨酸磷酸化在肿瘤发生中的功能重要性，研究团队检测了磷酸化缺陷的PI3Kβ突变体能否模拟PI3Kβ基因敲除的效果，并在体内抑制PTEN缺失肿瘤的生长。研究利用了源自同时缺失Pten和Trp53并敲除Pik3cb的基因工程小鼠模型（GEMM）的原发性PPB肿瘤细胞。在PPB细胞中回补小鼠PI3Kβ野生型或磷酸化缺陷变体，结果显示Y956F突变体（对应人Y962F）或T924A/Y956F双突变体减少了PI3Kβ与EPHA2的结合。为了评估体内功能后果，研究团队将这些工程化的PPB肿瘤细胞原位移植到小鼠乳腺脂肪垫中。PI3Kβ野生型恢复了PPB细胞的致瘤能力，而Y956F和T924A/Y956F突变体恢复肿瘤生长的能力显著减弱，并伴有Ki67染色减少，表明增殖受损。这些结果表明PI3Kβ的磷酸化对于PTEN缺失的乳腺肿瘤生长至关重要。

研究团队将这一分析扩展至PTEN缺失的前列腺癌模型PC3细胞。在敲低内源性PI3Kβ后，过表达野生型或非磷酸化人PI3Kβ突变体（T930A, Y962F, T930A/Y962F），并将这些工程化的PC3细胞移植到裸鼠中。PI3Kβ野生型促进了强劲的肿瘤生长，而Y962F和T930A/Y962F突变体则大幅减弱了这种效应。一致地，表达Y962F或T930A/Y962F双突变体的肿瘤显示Ki67水平显著降低。这些数据共同表明，PI3Kβ的酪氨酸磷酸化在多种PTEN缺失癌症模型的体内致瘤过程中至关重要。

PI3Kβ-Y962磷酸化升高与人类乳腺癌和前列腺癌患者的PTEN缺失紧密相关

为了进一步评估PTEN介导的PI3Kβ^Y962磷酸化，研究团队开发了一种可特异性识别人PI3Kβ Y962位点磷酸化的多克隆抗体，该抗体也能与相应的小鼠位点（pY956）交叉反应。通过蛋白质印迹和免疫荧光实验验证，该抗体可选择性检测多个细胞系中过表达和内源性的p-PI3Kβ^Y962。接下来评估了PTEN表达与p-PI3Kβ^Y962水平之间的关系。免疫荧光分析显示，在BT549/PI3Kβ野生型和PC3/PI3Kβ野生型细胞中均有强烈的p-PI3Kβ^Y962染色信号，而在它们各自的Y962F对应细胞中该信号消失。蛋白质印迹证实，PI3Kβ敲低降低了p-PI3Kβ^Y962水平，重新表达PI3Kβ野生型可恢复其水平，但Y962F突变体不能。此外，在BT549细胞中外源表达PTEN显著降低了内源性p-PI3Kβ^Y962水平，而在PTEN野生型细胞中CRISPR介导的PTEN敲除则导致p-PI3Kβ^Y962信号显著增加。这些数据表明p-PI3Kβ^Y962受PTEN紧密调控。

利用这种经过验证的特异性抗p-PI3Kβ^Y962抗体，研究团队分析了两组独立的人类癌症患者队列中PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962水平的关系。首先，在10例携带PTEN突变和10例PTEN野生型、年龄和疾病分期匹配的三阴性乳腺癌（TNBC）病例中进行了多重免疫组化分析。引人注目的是，与PTEN野生型对照组相比，PTEN突变肿瘤患者中的p-PI3Kβ^Y962水平显著更高。线性回归分析进一步揭示了在该TNBC队列中PTEN表达与p-PI3Kβ^Y962水平之间存在强烈的负相关。此外，在PTEN缺失的肿瘤组织内，癌巢附近PTEN完整的间质细胞显示的p-PI3Kβ^Y962水平明显低于PTEN突变的肿瘤细胞，这加强了临床样本中PTEN缺失与p-PI3Kβ^Y962升高之间的联系。

为了扩展这些发现，研究团队分析了一个更大的包含106名临床特征相似的前列腺癌患者队列。与TNBC数据一致，携带PTEN突变的前列腺肿瘤显示出比PTEN野生型肿瘤显著更高的p-PI3Kβ^Y962水平，并且在整个队列中p-PI3Kβ^Y962水平与PTEN水平呈负相关。基于病理学的Gleason评分用于划分肿瘤侵袭性，评分7分表示中期，8-10分反映高级别、预后较差的肿瘤。PTEN水平在Gleason评分较高的患者中显著降低，而p-PI3Kβ^Y962水平在这些相同的高级别肿瘤中显著升高。这些数据共同表明，p-PI3Kβ^Y962水平与PTEN缺失显著相关，并且与三阴性乳腺癌和前列腺癌的不良临床预后相关，突显了其作为预后生物标志物的潜力。

PI3Kβ磷酸化促进EPHA2结合以激活PTEN缺失肿瘤细胞中的pERK/c-MYC和AKT信号

研究团队接下来探究了PI3Kβ-Y962磷酸化如何通过其与EPHA2的相互作用影响PTEN缺失肿瘤细胞中的下游信号传导。鉴于EPHA2作为一种受体酪氨酸激酶（RTK），可通过与AKT通路的相互反馈环路进行调节，并在多种癌症中促进PI3K/AKT和pERK/c-MYC信号，研究假设PTEN缺失使PI3Kβ-Y962磷酸化得以增强EPHA2结合并激活致癌通路。

支持这一假设的是，PI3Kβ敲低选择性地降低了PTEN缺失乳腺癌模型（包括BT549细胞和源自同时缺失Pten和Trp53的GEMM的PP细胞）中的pERK和c-MYC水平。研究结果表明，PTEN缺失的肿瘤依赖PI3Kβ来维持pERK/c-MYC信号，该通路对实体瘤进展至关重要。

为了评估PTEN磷酸酶活性在调节该通路中的作用，研究团队将PTEN野生型和突变体重新引入PTEN缺失的BT549细胞。PTEN野生型和G129E（脂质磷酸酶缺陷）显著降低了pERK和c-MYC水平，而Y138L（蛋白磷酸酶缺陷）和C124S（双功能磷酸酶缺陷）则未能降低。这些结果表明，PTEN的蛋白磷酸酶活性（而非其脂质磷酸酶功能）对于抑制PTEN缺失癌症中的ERK/c-MYC通路至关重要。

接下来研究了PI3Kβ磷酸化在调节PTEN缺失肿瘤细胞中pERK/c-MYC信号的作用。在PI3Kβ敲低的BT549细胞中，重新表达PI3Kβ野生型、T930A突变体或激酶失活突变体K805R恢复了pERK和c-MYC表达，而Y962F和T930A/Y962F突变体则未能挽救该信号传导。在PPB细胞中回补野生型或突变体PI3Kβ也观察到类似结果。在PTEN充足的细胞中，过表达磷酸模拟突变体PI3Kβ-Y962E和T930E/Y962E显著增加了pERK和c-MYC水平，强调了PI3Kβ-Y962磷酸化对ERK/c-MYC激活的特异性贡献。

为了确定PI3Kβ–EPHA2相互作用是否参与该通路，研究团队在PTEN缺失的BT549细胞中破坏了EPHA2功能。EPHA2的基因敲除和药理抑制均显著降低了pERK和c-MYC蛋白水平，支持了PI3Kβ–EPHA2信号在驱动pERK/c-MYC激活中的作用。此外，在PI3Kβ敲低的BT549细胞中，重新引入PI3Kβ野生型恢复了EPHA2活性，而Y962F和T930A/Y962F突变体则没有。

为了进一步阐明ERK–c-MYC轴作为p-PI3Kβ^Y962–EPHA2信号下游效应器在PTEN缺失细胞中的作用，研究团队检测了其对内源性PI3Kβ敲低的BT549细胞的影响。重新表达PI3Kβ导致p-ERK1/2、p-cMYC^S62和总c-MYC蛋白水平增加。值得注意的是，通过shRNA沉默ERK或药理抑制ERK显著抑制了c-MYC蛋白水平，特别是p-cMYC^S62，但不影响c-MYC mRNA表达，表明ERK通过促进其稳定而非转录来作用于c-MYC上游。此外，阻断ERK或c-MYC活性均损害了在缺乏内源性PI3Kβ的BT549细胞中PI3Kβ过表达诱导的增殖效应。这些发现表明，PI3Kβ-Y962磷酸化增强了EPHA2介导的ERK激活，从而稳定c-MYC并驱动PTEN缺失肿瘤细胞的增殖。

由于在BT549-shPIK3CB细胞中重新表达PI3Kβ Y962F或T930A/Y962F突变体会导致p-AKT水平降低，与激酶失活突变体PI3Kβ K805R观察到的效果相当，研究团队评估了这些磷酸化位点突变是否损害了脂质激酶活性。使用ADP-Glo脂质激酶检测法证实，K805R缺乏激酶活性，而T930A、Y962F和T930A/Y962F突变体保留了正常的脂质激酶功能。

有趣的是，尽管K805R突变体失去了催化活性且p-AKT信号受损，但它仍保持与EPHA2结合并促进ERK/c-MYC通路激活的能力。这些发现表明，独立于其酶活性的PI3Kβ磷酸化，对于结合EPHA2和触发下游ERK/c-MYC信号至关重要。此外，Y962磷酸化对p-AKT激活也很重要的观察结果表明，EPHA2相互作用增强了PI3Kβ在细胞膜上的可及性，促进了PTEN缺失背景下PIP2的磷酸化和p-AKT信号传导。

SRC–EPHA2–PI3Kβ三方复合物驱动PTEN缺失肿瘤的致癌信号

鉴于p-PI3Kβ^Y962在PTEN缺失癌症中的关键作用，研究团队试图确定负责其磷酸化的酪氨酸激酶。首先应用了Cantley实验室开发的基于基序的预测算法，对所有酪氨酸激酶磷酸化PI3Kβ Y962位点的潜力进行评分。该分析确定了主要来自EPHA家族（EPHA1, EPHA2, EPHA3）和SRC家族（FES, PYK2, ACK, LYN, SRMS）的顶级候选激酶。

为了补充这种计算方法，研究团队使用60种针对排名靠前激酶的酪氨酸激酶抑制剂进行了靶向化合物筛选。该筛选在PTEN缺失的BT549和PC3细胞中进行，这些细胞中的内源性PI3Kβ被PI3Kβ野生型或PI3Kβ-Y962F突变体取代。筛选旨在识别能有效抑制表达PI3Kβ野生型的癌细胞，但对表达PI3Kβ-Y962F突变体的细胞效果较弱的化合物，从而突出可能特异性靶向p-PI3Kβ^Y962的抑制剂。值得注意的是，两种SRC抑制剂——达沙替尼（Dasatinib）和KX2-391——位列前列，它们显著降低了PI3Kβ野生型细胞的生长，但在表达Y962F突变体的细胞中效果减弱。这些结果表明，SRC抑制可能有效靶向PTEN缺失癌症中的p-PI3Kβ^Y962。事实上，达沙替尼不仅降低了SRC的磷酸化并抑制了细胞生长，还显著降低了多个PTEN缺失癌细胞中的p-PI3Kβ^Y962和pERK/c-Myc蛋白水平。KX2-391也证实了类似效果，同样降低了BT549细胞中的p-PI3Kβ^Y962和c-Myc。此外，两种抑制剂均显著损害了表达PI3Kβ野生型的PPB细胞的生长，但对表达PI3Kβ-Y956F突变体的PPB细胞效果较差。这些结果表明p-PI3Kβ^Y962是一个可成药的靶点，可以被激酶抑制剂有效抑制。

研究团队发现，敲低SRC或EPHA2降低了BT549细胞中PI3Kβ-Y962的磷酸化和c-MYC水平。SRC与EPHA2协同磷酸化PI3Kβ。在PTEN野生型和PTEN敲除细胞中过表达SRC-Flag和EPHA2质粒，然后进行Flag免疫沉淀和蛋白质印迹分析，证实了这种协同作用。体外实验表明，SRC和EPHA2直接在体外磷酸化PI3Kβ-Y962肽段，并且对Y962位点突变的PI3Kβ的磷酸化活性减弱。特别是，SRC能强烈磷酸化PI3Kβ-Y962。进一步的机制研究表明，敲低SRC dramatically降低了BT549细胞中p-PI3Kβ^Y962–pERK/c-Myc轴的信号，这种效应可以通过外源表达EPHA2得到轻微挽救。敲低EPHA2也降低了该轴的信号，但外源表达SRC无法挽救shEPHA2的效果。SRC表达升高了BT549细胞中的p-ERK和c-Myc水平，而EPHA2敲除则消除了这种效应。

综上所述，本研究揭示了一个新的机制模型：PTEN缺失导致PI3Kβ在Y962位点的酪氨酸磷酸化升高，磷酸化的PI3Kβ与EPHA2和SRC形成稳定的三方复合物。该复合物的组装进一步激活了EPHA2和下游的pERK/c-MYC致癌信号通路，同时通过将PI3Kβ募集至膜上也可能促进了经典的PI3K/AKT通路激活。研究开发的p-PI3Kβ^Y962特异性抗体证实了其