《Postharvest Biology and Technology》：SlERF.F4 negatively regulates tomato fruit susceptibility to
Botrytis cinerea independently of ripening traits
编辑推荐：
番茄是全球重要的经济作物，但其果实在采后贮运中易感染灰霉菌(Botrytis cinerea)，造成巨大损失。研究人员聚焦于乙烯响应因子SlERF.F4，通过生理生化、转录组、DNA亲和纯化测序(DAP-seq)和双荧光素酶报告基因等技术，发现SlERF.F4通过激活抗氧化酶活性与病程相关(PR)基因表达，减轻氧化损伤，从而降低果实对灰霉菌的易感性，且不损害果实成熟与品质。该研究为培育兼具优质和抗病性的番茄品种提供了新靶点。
想象一下，你从超市精心挑选了一颗红润饱满的番茄，准备几天后用它做一道美味佳肴。然而，几天后却发现番茄表面出现了令人沮丧的灰色霉斑，这就是由灰霉菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病。这种病害是全球番茄生产的主要威胁之一，不仅在田间可造成10%-20%的产量损失，在采后贮藏和运输过程中也会导致巨大的经济损失。更棘手的是，番茄果实在成熟过程中，会变得更加美味多汁，但同时也变得更易受到灰霉菌等病原菌的侵染。因此，如何在保证番茄优良品质和成熟特性的同时，增强其采后抗病性，是农业和食品科学领域长期面临的重大挑战。
为了攻克这一难题，科学家们将目光投向了植物体内一类关键的调控因子——乙烯响应因子(Ethylene Response Factors, ERFs)。这类转录因子是植物激素信号通路（如乙烯、茉莉酸）下游的重要“开关”，能够调控众多与抗病、抗逆相关的基因表达。在番茄中，已鉴定出多达137个SlERF基因，但它们在果实抵抗灰霉菌侵染过程中的具体作用和分子机制，特别是如何在不影响果实品质的前提下发挥作用，仍有许多未解之谜。本研究发表在《Postharvest Biology and Technology》期刊，重点关注了一个在果实绿熟期高表达、且能被灰霉菌侵染强烈诱导的基因——SlERF.F4。研究人员开展了一系列实验，旨在阐明SlERF.F4是否以及如何调控番茄果实对灰霉菌的抗性，并探究其对果实成熟和品质有无影响。研究结论揭示，SlERF.F4通过增强抗氧化酶活性、激活病程相关基因的表达，有效减轻了病原侵染导致的氧化损伤，从而在不影响果实正常成熟和采后品质的前提下，降低了果实对灰霉菌的易感性。这为未来通过分子育种手段培育抗病优质番茄新品种提供了重要的理论基础和基因资源。
本研究采用了多学科交叉的实验方法。研究人员首先利用CRISPR/Cas9技术构建了SlERF.F4的敲除突变体(F4-KO)，同时通过RNA干扰(F4-RI)和过表达(F4-OE)技术获得了具有不同SlERF.F4表达水平的转基因番茄株系。以野生型番茄(WT)为对照，在红熟期果实的特定位置接种灰霉菌孢子悬液，系统评估了不同基因型果实的发病情况、病斑大小等表型。利用生化方法检测了与氧化胁迫相关的指标，包括超氧阴离子(O2-)、丙二醛(MDA)含量，以及超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)的活性。通过转录组测序(RNA-seq)技术比较了野生型和突变体果实接种病菌后的基因表达差异。为了解析SlERF.F4的直接下游靶基因，研究利用了公共数据库中的DNA亲和纯化测序(DAP-seq)数据，并结合双荧光素酶报告基因实验验证了SlERF.F4对候选靶基因启动子的结合与转录调控能力。此外，还通过外源激素处理和凝胶迁移实验(EMSA)等技术，探索了茉莉酸信号通路关键转录因子MYC2对SlERF.F4基因的上游调控。
SlERF.F4负调控番茄果实对灰霉菌的易感性
研究人员发现，SlERF.F4在番茄果实的绿熟期表达量较高，且在被灰霉菌侵染后表达显著上调。与野生型果实相比，敲除或敲低SlERF.F4的果实对灰霉菌表现出显著增强的易感性，病斑更大，发病更早；而过表达SlERF.F4的果实则表现出轻微的抵抗力增强。这些表型证据直接表明SlERF.F4负向调控番茄果实对灰霉菌的易感性。
SlERF.F4通过增强ROS清除能力缓解氧化损伤
病原侵染会引发活性氧(ROS)爆发。研究发现，SlERF.F4功能缺失的果实中，超氧阴离子和氧化损伤标志物MDA的含量更高，而关键的抗氧化酶SOD和POD的活性则显著降低。相反，过表达株系中抗氧化酶活性有所提升。这表明SlERF.F4通过增强果实的抗氧化酶系统，有效清除了过量的ROS，从而减轻了由病原侵染引起的细胞氧化损伤，这是其降低果实易感性的重要生理机制之一。
SlERF.F4调控的转录组分析
通过RNA-seq技术比较野生型和F4-KO突变体果实接种病菌后的基因表达谱，发现大量差异表达基因富集在“对真菌的反应”、“免疫反应”和“氧化应激反应”等通路。值得注意的是，多个病程相关(PR)基因，如PR2a、CHI1和PR-STH2，在突变体中的诱导表达受到显著抑制。这提示SlERF.F4可能通过调控这些抗病相关基因的表达来发挥作用。
SlERF.F4直接结合并反式激活PR基因表达
为了进一步验证上述猜想，研究整合了DAP-seq数据和转录组数据，发现SlERF.F4能够直接结合到PR2a等基因的启动子区域。双荧光素酶报告基因实验证实，SlERF.F4可以直接反式激活PR2a、CHI1和PR-STH2等PR基因的启动子活性。这从分子机制上解释了为什么SlERF.F4的缺失会导致这些抗病基因表达下调。
SlERF.F4是茉莉酸信号通路下游MYC2的靶基因
茉莉酸(JA)是植物抵抗灰霉菌的主要防御激素。研究发现，SlERF.F4的表达能被茉莉酸甲酯(MeJA)强烈诱导，但不能被乙烯显著诱导。进一步的实验证明，茉莉酸信号通路的核心转录因子MYC2能够直接结合到SlERF.F4基因启动子的特定序列(ACCGACA motif)上，并显著激活其表达。这表明SlERF.F4是JA/MYC2信号通路下游的一个关键节点，将上游的激素信号与下游的抗病基因表达连接起来。
SlERF.F4不影响果实成熟或采后品质
一个优良的抗病基因靶点不应以牺牲作物品质为代价。令人振奋的是，该研究通过系统评估发现，无论是对SlERF.F4进行敲除、敲低还是过表达，番茄果实在从开花到破色期的时间、不同成熟阶段的色泽、类胡萝卜素含量、果实硬度、可溶性固形物含量以及采后贮藏35天的失水率等关键成熟与品质性状上，与野生型相比均无显著差异。这明确证实了SlERF.F4在增强抗病性的同时，不会对番茄果实的正常成熟过程和采后品质产生不利影响。
结论与意义
本研究系统阐明了转录因子SlERF.F4在番茄果实抵御灰霉菌侵染中的关键作用及其分子机制。研究构建了一个清晰的调控模型：当灰霉菌侵染番茄果实时，茉莉酸信号被激活，其核心转录因子MYC2直接结合并上调SlERF.F4的表达。随后，SlERF.F4发挥其转录调控功能，一方面直接反式激活PR2a(β-1,3-葡聚糖酶)、CHI1(几丁质酶)和PR-STH2(核糖核酸酶类似蛋白)等多个病程相关(PR)基因的表达，这些PR蛋白能直接攻击病原菌的细胞壁或核酸，发挥抗菌作用；另一方面，SlERF.F4通过增强SOD、POD等抗氧化酶的活性，并可能调控POX1、PDH等氧化应激相关基因，有效维持细胞内的氧化还原平衡，减轻病原侵染引发的氧化损伤。这两方面的协同作用，共同构建了果实抵御灰霉菌的防线。
这项研究最重要的发现在于，SlERF.F4介导的这一套精密的防御系统，是在不影响番茄果实正常成熟进程和关键品质性状的前提下运行的。这解决了作物育种中“抗病”与“优质”往往难以兼得的矛盾，使得SlERF.F4成为一个极具应用潜力的分子育种靶点。通过基因编辑或分子标记辅助选择等技术手段操纵SlERF.F4的表达或功能，有望培育出既保持优良风味和营养价值，又具有更强采后抗病性的番茄新品种，这对于减少采后损失、保障食品安全和提升产业效益具有重要的理论与实践意义。该研究也为深入理解其他果实作物中ERF转录因子协调品质形成与抗病应答的机制提供了有价值的参考。
