《Nature Microbiology》：Spatial transcriptomics maps host–gut microbiome biogeography at high resolution
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本方法巧妙地将原位聚腺苷化（PAP）与商业空间RNA测序（spatial RNA-seq）平台结合，显著提升了微生物RNA的捕获效率（最高达100倍），实现了肠道中宿主与微生物在1微米高分辨率下的空间互作图谱绘制。该技术揭示了小鼠肠道微生物组的空间异质性、短距离微生物间互作以及肿瘤相关宿主-微生物界面的结构变化，为在健康和疾病状态下研究宿主-微生物互作提供了强大、可扩展的新工具。
空间转录组学技术解析宿主-肠道微生物组的高分辨率生物地理图谱
引言：揭示原位互作的新窗口
长久以来，肠道微生物组被认为是一个具有类组织特性的“器官系统”，其功能由微生物与宿主细胞间的复杂互作所定义。然而，由于缺乏合适的原位测量工具，深入研究宿主-微生物的互作一直面临挑战。传统的成像技术虽能定位特定微生物，但在多重检测能力、获取宿主功能或转录响应信息方面存在局限。近年来，空间分辨RNA测序（spatial RNA-seq）已成为在完整组织中分析基因表达并保留空间背景的强大工具，但其商业平台主要针对宿主的多聚腺苷酸化（polyA）转录本进行优化，对缺乏polyA尾的微生物RNA捕获效率低下。本研究旨在突破这一瓶颈，通过一种创新的方法，实现对宿主与肠道微生物组互作的高分辨率空间测绘。
核心方法：原位聚腺苷化赋能微生物RNA捕获
本研究开发的方法核心在于，在标准空间转录组学工作流程中，于组织切片上增加一个酶促原位聚腺苷化步骤。该方法利用酵母多聚腺苷酸聚合酶（yPAP），在固定、切片和染色后，对切片上的细菌RNA和宿主RNA进行原位聚腺苷酸化处理。这一关键步骤使得原本缺乏polyA尾的微生物RNA能够被空间转录组芯片上的寡聚脱氧胸苷酸（oligo(dT）探针高效捕获。
研究团队在低分辨率（Visium平台，~55微米点距）和高分辨率（Stereo-seq平台，~0.5微米像素）的商业平台上验证了该方法的有效性。结果表明，原位聚腺苷化能将细菌RNA的回收率提升高达100倍，同时保持了宿主基因的高捕获效率。此外，该方法还能显著富集多种宿主非A尾RNA，包括未剪接mRNA、核糖体RNA（rRNA）、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）等，实现了“总转录组”的空间测绘。该方法兼容多种商业平台，增加了其可及性和可扩展性。
低分辨率平台下的初步发现：微生物组的纵向与横向分布
应用该方法，研究团队首先在小鼠胃肠道四个部位（近端小肠、回肠、盲肠和结肠）进行了低分辨率空间转录组分析。研究发现，从近端小肠到结肠，每个空间点（spot）的微生物属水平丰富度逐渐增加。在横轴方向上（从组织到肠腔），不同微生物类群呈现出明显的分布差异。例如，在回肠，放线菌门（Actinomycetota）和变形菌门（Pseudomonadota）在靠近黏膜和组织层更丰富，而拟杆菌门（Bacteroidota）则偏好存在于远离组织的肠腔区域。在盲肠和结肠，厚壁菌门（Bacillota）在各个区域均占主导，但在肠腔中水平更高。这些发现与已知的肠道微生物生物地理学特征一致。
高分辨率测绘：揭示微米级的生态细节
为了在更高空间尺度上解析宿主-微生物界面，研究在Stereo-seq平台上对小鼠回肠组织进行了分析，达到了约0.5微米的分辨率。通过整合宿主基因表达、细胞类型解卷积和微生物信号，生成了宿主-微生物组界面的详细视图。
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宿主转录组的空间模式：宿主基因表达在空间上呈现非均匀分布。例如，成熟的肠上皮细胞在绒毛顶端表现出更高的基因表达水平和多样性。未剪接mRNA（可能代表新生转录本）在隐窝基底部的比例更高，可能与快速增殖的转运扩增细胞（TA细胞）相关。研究还发现了沿隐窝-绒毛轴分布的标志性编码和非编码RNA分子。
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微生物的微尺度空间组织：高分辨率数据揭示了微生物在回肠中的微尺度空间组织特征。细菌的丰度和多样性在靠近宿主边界处较低。空间自相关分析（莫兰指数）显示，54个属的细菌表现出显著的聚集性，表明存在菌落形成。利用Ripley‘s H函数进一步推断菌落大小，发现不同属的细菌形成不同大小的菌落，例如*乳杆菌*（Lactobacillus）形成的小菌落半径小于10微米，而*梭菌*（Clostridium）可形成半径大于30微米的大菌落。空间共定位分析还揭示了不同菌属（如*Turicimonas*和*Sutterella*）之间存在强相关性。
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物种-面积关系：研究测量了生态位面积大小与观察到的独特物种数量之间的关系。在16平方微米到0.16平方毫米的三个数量级范围内，观察到的属数量与采样面积之间遵循幂律关系，幂指数为0.47，这表明相对于已报道的植物、动物和环境生态系统，小鼠回肠微生物组具有相对较高的空间分散度。
聚焦肿瘤-微生物组界面：结构与互作的重塑
在患有肠道肿瘤（APCMin/+小鼠模型）的回肠组织中，研究比较了肿瘤边缘和正常组织的微生物组。分析发现，在正常组织中，微生物在距离宿主绒毛100-200微米处密度最高；而在肿瘤组织中，微生物的密度峰值直接出现在与肿瘤的边界上。具体而言，*梭菌*、*乳杆菌*和*副拟杆菌*（Parabacteroides）与肿瘤边缘紧密相关。宿主细胞结构也发生了显著变化：在正常组织中，成熟的肠上皮细胞最接近宿主-微生物边界，而潘氏细胞位于隐窝基底部；在肿瘤区域，与肿瘤相关的转运扩增细胞以及树突状细胞、巨噬细胞、CD8+T细胞等免疫细胞则富集在肿瘤内部。这些结果表明，肿瘤改变了局部宿主组织结构和微生物的空间分布，可能导致界面互作的增加。
讨论与展望：潜力与局限
本研究证明，结合原位聚腺苷化的空间转录组学为在空间尺度上研究肠道微生物生态学和宿主-微生物组互作打开了一扇新窗。该方法能够绘制微生物以及宿主A尾和非A尾转录组的空间图谱，揭示了微生物类群内部和之间的互作、菌落形成，以及肿瘤-宿主界面处微生物空间结构的改变。
当然，该方法也存在一些局限性。商业空间转录组学平台的成本仍然较高，可能阻碍其广泛采用。由于聚腺苷化导致读数在编码RNA、非编码RNA和微生物RNA之间重新分配，宿主mRNA基因的测序深度会相对降低，但可以通过加深测序来缓解。与针对特定转录本的成像方法相比，测序方法的灵敏度较低，这限制了其对低丰度微生物或特殊细胞状态的检测。此外，捕获过程中可能出现信号扩散、组织切片错位以及当前数据库和分类方法导致的序列错误分类，因此严格的对照和正交验证至关重要。
未来，通过优化文库制备化学、固定方案、结合长读长测序以及改进宿主和微生物rRNA去除等方法，有望进一步提高非编码RNA和微生物mRNA转录本的捕获效率。推动该方法与福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织的兼容性，将极大地扩展其在病理学中的应用。最后，开发能够整合宿主编码、非编码和微生物信号的新计算工具也至关重要。
尽管存在挑战，空间转录组学无疑将成为探索肠道免疫学、微生物在黏液和组织中的定植、隐窝等微小生态位中的微生物组，以及癌症相关微生物组等前沿问题的强大工具。它有望在炎症性肠病等已知有微生物组参与的疾病研究中发挥重要作用，深化我们对宿主-微生物这一复杂共生关系的理解。
