《Renewable Energy》：Energy efficient electric field-assisted green extraction of yeast oil for advanced biodiesel production
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单细胞油（SCO）作为工业生物燃料原料，其高效提取技术对降低环境成本至关重要。本研究采用低电压恒电场电渗透预处理（CEF-EP）技术，在10V/cm、2分钟优化条件下，利用生物基溶剂2-甲基四氢呋喃提取Lipomyces starkeyi酵母细胞中的单细胞油，提取率达30.0 wt%，与传统酸法相当，且显著减少能耗和污染。提取的SCO经红外光谱表征后，通过酸催化酯交换反应制备出产率84 wt%的高级生物柴油，其理化性质与标准生物柴油（EN 14214、ASTM D6751）相当，且碳排放减少67%。该技术通过电场渗透替代传统破坏细胞壁方法，结合绿色溶剂，为可持续生物燃料生产提供新路径。
安娜·玛丽亚·拉斯波利·加莱蒂（Anna Maria Raspolli Galletti）|尼古拉·迪·菲迪奥（Nicola Di Fidio）|费德里科·托齐（Federico Tozzi）|克劳迪娅·安东内蒂（Claudia Antonetti）|詹卢卡·卡波斯基乌蒂（Gianluca Caposciutti）|加布里埃莱·班迪尼（Gabriele Bandini）|米尔科·马拉奇（Mirko Marracci）|贝尔纳多·泰利尼（Bernardo Tellini）
比萨大学化学与工业化学系，意大利比萨市G. Moruzzi街13号，邮编56124
摘要
单细胞油（Single Cell Oil，SCO）是一种用于工业应用的新型油脂，旨在替代食用油作为生物燃料和化学品的原料。SCO大规模生产的主要瓶颈之一是传统从酵母细胞中提取SCO的方法所涉及的成本和环境影响。本研究开发了一种实验室规模的装置，用于预处理Lipomyces starkeyi细胞，以提高脂质提取效率。该过程采用低功率、低电压的电场处理装置来渗透细胞膜，随后使用生物基溶剂2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）进行脂质提取。在优化条件下（10 V/cm，2分钟），提取的SCO细胞含量（30.0 wt%）与标准酸催化方法相当。提取的SCO通过红外光谱进行分析，并用于生产高级生物柴油，产率为84 wt%。这种新型生物燃料的脂肪酸组成（FAMEs）和物理化学性质得到了测定，并与标准生物柴油（EN 14214和ASTM D6751标准）进行了比较。特别是在下一代生物柴油的生产方面，这一新工艺具有显著潜力，能够替代传统的细胞处理方法，提高效率和可持续性。
引言
欧洲能源指令RED II对使用与食品链竞争的原料进行了限制，同时鼓励利用残余生物质和废弃物生产先进生物燃料[1]。单细胞油（SCO），也称为微生物油，已被认为是生产生物燃料和化学品的可行且可持续的原料[2,3]。SCO是由微生物（通常是单细胞生物，如酵母、细菌或微藻）在特定生长条件下在细胞内积累大量脂质（油）而合成的一种新型油脂[2]。这些油脂在类型和成分上与植物或动物中的油脂相似，常用于各种工业应用[5,6]，因此成为食用油的有希望的替代来源。事实上，SCO相比传统油脂来源具有多个优势，包括微生物能够在多种碳源上生长，包括农业食品部门和工业活动产生的各种废弃物和副产品[2]。这种灵活性使得SCO的生产更加环保，减少了对传统油料作物所需耕地的竞争。此外，SCO的脂肪酸组成可以根据特定营养和功能需求进行定制，使其成为食品、饲料、制药和生物燃料行业的宝贵资源[7,8]。SCO的生产有助于解决全球原油储备枯竭的问题，减少温室气体排放，并减轻传统石油提取和生产方法带来的环境影响[5]。此外，由SCO衍生的生物柴油和可持续航空燃料（SAF）因其无硫、无毒和可生物降解的特性而具有巨大潜力[8]。与石油柴油相比，SCO衍生的生物柴油燃烧时产生的碳氢化合物排放减少67%，二氧化碳排放减少48%，颗粒物排放减少47%，对使用系统的负面影响最小[8]。然而，SCO的生产涉及耗能大且耗时的细胞内油脂回收过程。正如Caporusso等人对产油酵母生产SCO的木质纤维素生物炼制厂进行的技术经济分析所报告的[9]，脂质生产最关键的瓶颈在于破坏细胞壁以释放脂质。从技术角度来看，脂质提取过程中的一个重要挑战是保持适当温度，以防止脂肪酸变质、氧化和油脂酸败[10]。文献中报道了多种从产油酵母中提取油脂的方法，如珠磨、微波照射、超声波处理、冷冻/解冻、高压均质化和冷干燥[11,12]。最近还研究了一些基于电场（E）的技术，如高脉冲电场电穿孔（HPEF-EP）、高压放电和中等脉冲电场辅助机械处理[13,14]。其中，HPEF-EP通过破坏细胞壁来提取微生物生物质中的脂质，随后用于生物柴油生产[15]。HPEF-EP的提取效率根据操作条件和酵母种类不同，介于30%到99%之间[13,14]。然而，由于细胞壁的厚度，HPEF-EP需要较高的电场强度才能达到所需的渗透效果。例如，为了使细胞壁破裂，通常需要10^8 V/m的电场强度（对于6-10 nm厚的细胞壁而言）[16]。HPEF-EP的电脉冲通过脉冲发生器传递到电极上。但是，长时间（几秒）施加高电场会导致温度显著升高，从而导致细胞死亡。在典型的生物技术方法中（如转染或转化），这种效应通常是不希望出现的。为了避免样品过热并暂时使细胞膜通透，脉冲可以采用方波脉冲形式（持续微秒级）或指数衰减的电容放电脉冲（持续毫秒级）[17]。迄今为止，HPEF-EP已用于将DNA和RNA引入植物、动物、细菌和酵母细胞，以及注射药物、蛋白质、代谢物、分子探针和抗体，以研究细胞结构和功能[18]。然而，HPEF-EP依赖于高功率，因此需要高电压和短时间脉冲，从而需要复杂的实验装置来生成所需的电场强度。
此外，常见的SCO提取和脂质纯化技术还存在另一个限制，即使用强酸和污染性有机溶剂（如氯化溶剂和甲醇），这不利于SCO的大规模环境可持续性[11,19,20]。
在这项工作中，研究了一种从Lipomyces starkeyi酵母细胞中提取油脂的新方法。具体来说，开发了一种基于低电压恒定电场电穿孔（CEF-EP）的酵母预处理方法，以渗透细胞膜，从而释放SCO。CEF-EP操作时耗电和功率较低，但其效率取决于所施加的电场强度、温度以及样品在设备中的停留时间。因此，进行了一项实验来评估SCO的提取效率，包括能耗和产率。通过计算脂质的提取产率，并将结果与标准方法（4 M HCl，60分钟，60°C，使用甲醇/氯仿作为提取溶剂）[7]进行比较，以验证该方法的有效性。随后使用氯仿/甲醇提取过程收集脂质，然后使用绿色溶剂2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）进行进一步比较。CEF-EP预处理和2-MeTHF提取过程都是现有技术上的创新。此外，在优化条件下提取的SCO通过红外光谱进行分析，并用于通过传统酸催化酯交换反应生产高级生物柴油。
我们的实验涵盖了广泛的操作条件，并对结果进行了全面分析，包括对生产出的生物柴油的物理化学特性进行了表征，证明这种新方法可以显著提高SCO和生物柴油生产的经济和环境可持续性。
试剂
试剂
酵母菌株Lipomyces starkeyi DSM 70296由DSMZ公司（德国）提供，为活化状态。葡萄糖（≥99%）、木糖（≥99%）、MgSO4·7H2O（≥98%）、KH2PO4（≥99%）、Na2HPO4·2H2O（≥99%）、FeSO4·7H2O（≥99%）、酵母提取物、HCl（37 wt%）、氯仿（≥99%）、甲醇（≥99%）、2-甲基四氢呋喃（2-MeTHF）（≥99%）、己烷（无水，≥99%）和脂肪酸甲酯混合物（C8-C22）由Merck公司购买，按接收状态使用。
用于酵母细胞恒定电场处理的实验室规模反应器
开发了一种专门用于细胞渗透的装置
SCO提取方法
细胞的质膜是一层薄薄的生物层，厚度约为6-10纳米，将细胞内部与外部环境分隔开来。膜两侧的电位差在许多关键生物过程中起着重要作用[27]。外部电场的应用会影响跨膜电位，从而导致膜受到机械应力和变形[16]
结论
在本研究中，开发了一种创新的实验室规模电穿孔（EP）装置，用于评估CEF-EP处理在渗透L. starkeyi酵母细胞壁和提取脂质以生产高级生物柴油方面的潜力。通过扫描电子显微镜图像初步观察了CEF-EP对细胞壁的影响。然后通过计算脂质的提取产率并与标准酸辅助方法的结果进行比较，评估了其效率
CRediT作者贡献声明
安娜·玛丽亚·拉斯波利·加莱蒂（Anna Maria Raspolli Galletti）：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。尼古拉·迪·菲迪奥（Nicola Di Fidio）：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、概念构思。费德里科·托齐（Federico Tozzi）：验证、数据分析。克劳迪娅·安东内蒂（Claudia Antonetti）：撰写——审稿与编辑、监督、数据分析。詹卢卡·卡波斯基乌蒂（Gianluca Caposciutti）：撰写——初稿、方法学、研究、数据分析、概念构思。加布里埃莱·班迪尼（Gabriele Bandini）：验证、方法学
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
尼古拉·迪·菲迪奥感谢RTD-A合同（编号1112/2021，协议编号0165823/2021）的支持，该合同由比萨大学与“研究与创新”（PON R&I FSE-REACT EU）计划（2014–2020年）以及“绿色主题研究合同”（Azione IV.6）共同资助。作者还感谢欧盟下一代计划（Next Generation EU）资助的PRIN 2022项目ReFil“从废水污泥中生产新一代可再生液体燃料：迈向循环经济”的支持，该项目属于任务4组件1（代码
