通过双引擎的酶促编辑和熵力实现三阶段信号放大，以超灵敏度检测急性白血病相关基因Pax-5a

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Triple-stage Signal Amplification via a Dual-engine of Enzymatic Editing and Entropic Force for Ultra-sensitive Detection of Acute Leukemia-associated Gene Pax-5a

高精度荧光生物传感器通过三阶段信号放大（SDA/SDR/HCR）实现Pax-5a基因超灵敏检测（检测限330 aM，范围1 fM-200 nM），并兼容1%血清干扰，为急性淋巴细胞白血病早期诊断提供新工具。

林海梅|张新怡|李洪波|余如琴

江西省绿色氢能与先进催化重点实验室，江西师范大学化学与材料学院，南昌330022，中国

摘要

建立高精度的Pax-5a基因检测系统对于实现急性白血病的早期筛查和预后预测具有重要意义。在此，我们成功开发了一种超灵敏的荧光生物传感器，用于检测Pax-5a，该传感器采用了由酶编辑和熵力双重驱动的三阶段信号放大策略。该系统利用链置换扩增（SDA）激活目标基因启动的分子机制，从而产生大量L链并实现第一级信号放大。接下来，采用了基于探针M的三链结构的脚手架介导的链置换反应（SDR），这一设计减少了目标基因回收过程的可逆性，并实现了二级信号的放大。最后，通过结合杂交链反应（HCR）实现了第三级信号放大。与传统单信号放大技术相比，这种方法使信号强度提高了数倍，检测限低至330 aM，检测范围宽达1 fM至200 nM。此外，该传感器在1%的人血清样本中表现出优异的信号恢复能力，这使得它能够分析复杂的底物环境，成为急性淋巴细胞白血病（ALL）筛查和早期临床诊断的有前景的工具。

引言

急性淋巴细胞白血病（ALL）是一种常见的恶性疾病，其特征是淋巴细胞的不受控制的恶性增殖以及早期分化能力的受损。这些异常淋巴细胞会侵入骨髓、血液和髓外部位[1]、[2]、[3]。该病在儿童中的发病率最高（占所有癌症病例的26%）[4]。在临床环境中，ALL患者通常会出现全身症状、出血、感染和/或骨痛[5]，这些表现可以作为诊断该疾病的基础。然而，由于ALL的症状具有特异性，其治疗和预后变得极具挑战性。因此，早期检测对于提高患者的生存率尤为重要[6]。研究表明，Pax-5a基因的异常表达不仅与人类B淋巴细胞恶性肿瘤的起始和发展密切相关，而且在维持癌细胞活力和促进转移过程中也起着关键作用[7]、[8]、[9]。因此，针对Pax-5a基因的分子检测方法成为急性淋巴细胞白血病的有效早期诊断手段。

目前，实时荧光定量聚合酶链反应（q-PCR）是最广泛使用的核酸检测技术[10]。然而，该技术存在一些缺点，包括对样本量的高要求、仪器和试剂的高成本以及有限的通量[11]、[12]、[13]，这些限制了其实用性。为了解决这些问题，基于等温扩增策略的核酸检测方法得到了显著发展，包括链置换扩增（SDA）[14]、[15]、杂交链反应（HCR）[16]、[17]、催化发夹组装（CHA）[18]、[19]和滚动循环扩增（RCA）[20]、[21]等。这些方法可以有效放大目标核酸分子的信号，并具有操作简便和成本低廉的优势[22]。近年来，CRISPR耦合扩增技术也因其高特异性和灵敏度而成为强大的核酸检测工具[23]。通过将CRISPR相关核酸酶与等温扩增策略结合，这些方法可以实现超低检测限[24]。然而，它们通常依赖于蛋白质酶和多个反应步骤，这可能会增加系统的复杂性、成本和操作要求，从而限制了其在某些临床环境中的应用。链置换反应（SDR）可以促进信号放大[25]，通常通过脚手架（DNA链）与入侵链结合引发三向或四向分支迁移来实现[26]、[27]。该反应产生双链产物，这种形成使得过程不可逆，同时显著提高了产物的稳定性。然而，信号放大效果较弱[28]。为了获得更好的传感性能，SDR常与其他核酸信号放大技术结合使用来开发生物传感器[29]。例如，Lan等人开发了一种人工DNA分子反应网络（DMRN），该网络由串联分子电路组成，通过双催化发夹组装与链置换反应（CHA-SDR）耦合，用于活细胞中的无蛋白酶和高特异性mRNA成像[30]。

在本研究中，我们开发了一种荧光生物传感器，巧妙地整合了SDA、SDR和HCR三种放大策略，这些策略由酶编辑和熵力的双重驱动——其中SDR和HCR都依赖熵力来促进反应进程。信号放大过程的第一步是使用特制的s-DNA探针识别目标并启动SDA反应。SDA的产物作为触发剂，引发脚手架介导的SDR反应，实现第二级信号放大。随后，SDR的反应产物又触发HCR，形成具有荧光特性的DNA纳米线，从而实现第三级信号放大。多种信号放大策略的级联提高了每个反应的利用效率，减少了假阳性信号的干扰，最终实现了对Pax-5a的超灵敏检测。

材料与试剂

关于材料、设备、试剂和其他实验技术的详细描述见支持信息。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

为了评估所设计生物传感器的可行性，进行了12%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。样品按照每组的实验方案制备。然后，将反应液与SYBR Green II（2 μL，100×）和加载缓冲液（2 μL，6×）混合，在黑暗中孵育10分钟。最后，取10 μL该溶液进行电泳。

传感平台的检测原理

如图1所示，本研究开发的三级核酸信号放大技术由酶编辑和熵力的双重驱动，实现了对Pax-5a基因的超灵敏和快速检测。在第一部分构建了一个分子网络。当存在目标基因Pax-5a时，SDA反应会产生大量L链，随后引发SDR反应。

结论

总之，我们开发了一种基于三级信号放大策略的高灵敏度荧光生物传感器，用于定量检测Pax-5a基因，检测限低至330 aM。其超高灵敏度得益于SDA的高效放大、辅助信号放大以及脚手架介导的SDR的热稳定性增强，以及无需复杂温度控制的等温HCR。该传感器的性能优于已报道的方法。

CRediT作者贡献声明

余如琴：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。 张新怡：正式分析，数据管理。 林海梅：撰写 – 原稿，研究调查，正式分析，数据管理，概念构思。 李洪波：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源获取，项目管理，方法学，资金申请，正式分析，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（项目编号：22164011、21565015、21663014）和化学生物传感与化学计量学国家重点实验室（Z2015022）的支持。

林海梅是中国江西省江西师范大学化学工程学院的硕士研究生，她的研究兴趣包括基于核酸的生物传感器放大和复杂酶功能的优化。