抑制自噬揭示ATR蛋白激酶是骨肉瘤顺铂敏感性的关键调节因子

《Cancer Medicine》：Inhibition of Autophagy Reveals ATR Protein Kinase as a Key Mediator of Cisplatin Sensitivity in Osteosarcoma

这篇研究揭示了骨肉瘤（OS）化疗耐药的新机制。研究表明，高水平自噬与更差的OS预后相关，而抑制自噬可增强OS细胞对顺铂（CIS）的敏感性。通过激酶筛选，该研究首次将ATR（ataxia telangiectasia and Rad3-related）蛋白激酶确定为连接DNA损伤应答（DDR）、自噬和化疗耐药的上游关键调控因子。抑制ATR可阻断p53（S15）的磷酸化并抑制自噬，从而显著增强顺铂诱导的细胞凋亡。这项研究为通过靶向ATR来克服OS化疗耐药、降低顺铂用药剂量及改善患者预后，提供了新的联合治疗策略。

1 引言

骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤。尽管化疗的引入提高了OS患者的生存率，但化疗耐药仍是导致不良生存结果的主要临床问题。本研究旨在探讨自噬在OS化疗耐药中的作用，并试图确定连接DNA损伤信号、自噬和化疗耐药的上游新调控因子。

2 结果

2.1 高水平的自噬与高分级OS患者较低的生存率相关

通过对OS组织微阵列进行LC3免疫组化染色，研究发现在高级别（3级）和晚期分期的OS肿瘤中，自噬水平显著升高。进一步对公开基因表达数据集（GSE42352）的分析显示，MAP1LC3B（编码LC3蛋白）基因高表达的OS患者，其总生存期和无转移生存期均显著低于低表达组。这些结果表明，自噬激活与OS不良疾病结局存在潜在关联。

2.2 化疗在体外诱导自噬

在HOS-143B细胞系中，顺铂（CIS）和阿霉素（DOX）的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为5 μM和0.75 μM。用IC₅₀剂量的化疗药物处理细胞后，自噬标志物分析显示，LC3-I向LC3-II的转化显著增加，同时自噬底物p62的蛋白水平下降，表明自噬流被激活。免疫荧光结果也证实化疗处理后细胞内的LC3斑点（自噬体标志）增多。

2.3 敲除ATG7可阻断自噬

利用CRISPR/Cas9技术稳定敲除（KO）HOS-143B细胞中的ATG7基因。在ATG7^?/?细胞中，ATG7的基因和蛋白表达均显著降低，同时LC3-II:LC3-I比率下降，p62蛋白积累，表明自噬被有效抑制。此外，ATG5-ATG12复合物的形成也被阻断，ATG5以游离形式存在，这进一步证实了ATG7的缺失完全阻断了自噬过程。

2.4 抑制自噬可增强化疗敏感性并降低细胞迁移

在ATG7^?/?细胞中，化疗诱导的自噬激活被持续抑制。剂量反应实验显示，ATG7敲除使细胞对CIS的敏感性显著增加，IC₅₀从野生型（WT）细胞的7.0 μM降至4.5 μM，但对DOX的敏感性无显著影响。划痕愈合实验表明，在DOX或CIS处理下，ATG7^?/?细胞的迁移距离相比对照细胞显著减少，提示自噬抑制降低了化疗处理后高侵袭性OS细胞的迁移潜能。

2.5 ATR的药理学抑制增强了顺铂敏感性

通过磷酸化激酶阵列分析，研究发现ATG7^?/?细胞中p53蛋白第15位丝氨酸（S15）的磷酸化水平降低。已知ATR（和ATM）激酶负责响应DNA损伤而磷酸化p53（S15）。随后，研究测试了ATM抑制剂（KU-60019）和ATR抑制剂（VE-821）与化疗联用的效果。结果显示，ATR抑制剂VE-821能显著增强HOS-143B细胞对CIS的敏感性，使CIS的IC₅₀降低约2倍，而ATM抑制剂则无此效果。为验证这是ATR抑制的类效应，研究测试了另外三种ATR抑制剂（BAY1895344, AZD6738, AZ20），它们均能显著增强CIS的细胞毒性作用，其中BAY1895344（0.01 μM）效果最为显著。

2.6 ATR的药理学抑制增强了细胞凋亡，并阻断了p53磷酸化和自噬

流式细胞术分析显示，CIS处理可诱导HOS-143B细胞凋亡，而CIS与ATR抑制剂（BAY-1895344）联用可进一步显著增加早期和晚期凋亡细胞的比例。Western blotting分析表明，CIS处理可大幅增加总p53及其S15位点的磷酸化水平，而联用ATR抑制剂则能同时降低总p53和磷酸化p53（S15）的蛋白水平。同时，ATR抑制还降低了ATG7的蛋白水平，并减少了LC3-I、LC3-II和p62的蛋白量，表明ATR抑制阻断了CIS处理所诱导的自噬通路。

3 讨论

本研究结果表明，自噬水平与OS患者的不良预后相关，且化疗可激活OS细胞的自噬作为一种保护机制。通过敲除ATG7抑制自噬，能够增强OS细胞对CIS的敏感性并降低其迁移能力。机制上，研究发现自噬抑制模型中p53（S15）的磷酸化降低，而通过小分子药物抑制负责此磷酸化的ATR激酶，能够模拟ATG7敲除的效果，增强CIS的敏感性。ATR抑制剂通过阻断磷酸化p53（S15）介导的DDR信号和ATG7依赖的自噬通路，从而促进CIS诱导的细胞凋亡。这些发现揭示了ATR是连接DDR、自噬和OS化疗耐药的一个关键节点。靶向ATR，与CIS联合使用，有望成为一种新的辅助治疗策略，通过降低所需CIS剂量来减少治疗毒性，同时克服化疗耐药，最终改善OS患者的临床结局。