《Separation and Purification Technology》：Targeted and untargeted analyses of desalination in superoxide dismutase fermentation broth by electrodialysis and ultrafiltration-electrodialysis
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本研究创新性地将超滤（UF）与电渗析（ED）结合用于SOD发酵液的脱盐。结果表明，UF-ED较ED能更有效地去除盐离子和其他代谢产物，提高SOD纯度，但总产量略低。蛋白质组学和代谢组学分析证实UF-ED能有效分离目标蛋白并减少杂质，适用于规模化生产。
Kun Chen|Yang Zhao|Yang Meng|Fuqing Gao|Haoda Zhao|Xiaojun Liao
中国农业大学食品科学与营养工程学院；国家果蔬加工工程技术研究中心；农业部果蔬加工重点实验室；北京食品非热加工重点实验室，北京，中国
摘要
本研究创新性地应用了超滤（UF）后接电渗析（UF-ED）工艺来脱盐超氧化物歧化酶（SOD）。本研究中，电渗析（ED）用于处理超滤截留液，而非之前报道的超滤渗透液。通过靶向和非靶向分析方法评估了ED和UF-ED对高密度发酵Pichia pastoris产生的SOD发酵液的脱盐效果。发酵液中的盐离子被有效去除，经过ED和UF-ED处理后的冻干蛋白的灰分含量分别为1.01%和1.77%。由于超滤浓度效应，UF-ED显著提高了蛋白浓度和SOD活性，但总蛋白产率（54.52%）低于ED处理的产率（62.35%）。蛋白质组学分析显示，ED和UF-ED处理后仅检测到SOD，表明其他由P. pastoris分泌的蛋白质被有效去除。此外，非挥发性代谢组学分析表明UF-ED比ED去除了更多的发酵液中不需要的代谢物，而基于挥发性代谢组学的分析则显示其在去除不良气味和增强愉悦气味方面表现更优，从而获得了纯度更高的SOD产品。总体而言，综合分析表明UF-ED是更适合SOD发酵液脱盐的工艺，可用于SOD的规模化生产和纯化。
引言
超氧化物歧化酶（SOD）是一种关键的抗氧化金属酶，能够特异性催化超氧阴离子的歧化反应生成过氧化氢和氧气，在维持生物体内的氧化还原平衡中起着关键作用（Del Valle和Scheckhuber [11]；Li等人 [11]）。传统的从动物血液 [20] 和植物 [17] 中提取SOD的方法以及筛选高产SOD菌株 [1] 的方法存在产率低和耗时长的问题，这限制了SOD的广泛应用。随着生物技术的发展，基于基因工程技术的多种表达系统已被构建用于生产重组蛋白 ([11]；产率较低 [11])。这些系统具有许多优势，包括成本低、生产周期短、易于基因操作以及适合规模化生产 [14]、[32]、[43]。目前，来自不同来源的SOD已成功在大肠杆菌 [39]、P. pastoris [6] 和枯草芽孢杆菌 [44] 中表达。在我们之前的工作中，实现了从栗花蔷薇中异源表达CuZnSOD，在工程化的E. coli 和P. pastoris 中分别获得了具有14,832 U/mg和13,476 U/mg高比活性的重组CuZnSOD [51]。P. pastoris系统的优势在于能够将SOD直接分泌到培养基中，简化了下游纯化过程，从而提高了纯化蛋白的产率。因此，P. pastoris是进行规模化发酵的更好选择。基于合成生物学的精准发酵需要根据选定的底盘细胞和目标产品特性定制工艺 [12]。在这个过程中，选择发酵培养基 [39] 和设计分离纯化策略 [51] 尤为关键。BMGY和BMMY是常用的P. pastoris培养和诱导培养基 [51]。然而，以复杂有机化合物为主要营养来源的培养基往往会产生大量代谢副产物和培养基衍生杂质，从而大幅增加规模化发酵的生产成本。为了克服这些限制，无机盐培养基更具经济性和成分简单性，更适合SOD的规模化生产。因此，我们在50 L发酵罐中使用了FM22培养基进行P. pastoris的高密度发酵以生产SOD，其中无机盐是主要杂质。因此，脱盐是后续分离纯化过程中最关键的步骤。
分离和纯化是获得高质量蛋白质产品的关键步骤，脱盐是其中的关键技术之一。由于商业蛋白质产品对盐含量的严格要求（通常通过灰分含量来评估），在干燥阶段之前对发酵液进行脱盐是必要的。传统的蛋白质脱盐方法，如透析 [36] 和凝胶柱 [8]，在规模化应用时存在吞吐量低、可扩展性差和性能不稳定等固有局限性。为了解决这些规模化问题，基于膜的分离技术被越来越多地探索作为蛋白质脱盐的更可扩展的替代方案。最近在膜分离技术方面的进展促进了电渗析（ED）在脱盐中的应用 [42]，其中电场力驱动盐离子穿过离子交换膜。尽管ED已被证明是一种有效的脱盐技术，但其工业应用受到处理大量进料流时效率降低以及随后给下游干燥过程带来大量负担的限制。超滤（UF）也是一种基于膜的分离技术，通过压力驱动的传输实现样品分离 [19] 和浓缩 [10]。因此，结合UF和ED的策略值得考虑，包括UF后接ED（UF-ED）和ED后接UF（ED-UF）两种配置。含盐乳清的超滤渗透液进一步用于电渗析过程以实现脱矿，从而回收乳糖和盐 [35]。在酪蛋白生产中，首先使用UF保留蛋白质，防止蛋白质进入电渗析系统 [30]。然后对无蛋白的渗透液进行脱盐并通过电渗析进行电酸化，再将其重新加入蛋白质截留液中以诱导酪蛋白沉淀。UF-ED也广泛用于工业废水的脱盐 [21] 和资源回收，包括氯化胆碱-乙二醇深共晶溶剂 [25]、离子液体 [24]、氟化物和硅氟化钠 [33] 以及染料 [27]。该方法同样涉及先通过UF分离大分子成分，然后对超滤渗透液进行电渗析处理以实现脱盐和资源回收。据报道，ED-UF在浓缩牛奶的生产中也有应用 [29]，脱脂牛奶通过电渗析进行电酸化作为传统酸化剂的替代方案，随后使用UF进行浓缩。根据我们对蛋白质脱盐的要求，本研究中的UF-ED配置比ED-UF更适合处理我们的SOD发酵液。据我们所知，目前尚无关于UF-ED用于蛋白质纯化的报道，特别是将ED作为UF蛋白截留液的后续处理方法。因此，我们开发了一种集成的UF-ED工艺用于蛋白质脱盐，并将其脱盐效果与单独使用UF和ED进行了比较。
在酵母发酵过程中，会分泌多种次级代谢物和挥发性化合物 [7]、[37]，这些也可能成为蛋白质发酵液中的潜在杂质并对最终产品质量产生负面影响。以往的蛋白质脱盐研究主要集中在目标产物上，缺乏对发酵液中次级代谢物和挥发性化合物的系统性评估。因此，首先使用代谢组学对脱盐后的发酵液中的化合物变化进行了非靶向分析。
本研究使用靶向和非靶向分析方法研究了UF-ED和ED对P. pastoris产生的SOD发酵液的脱盐效果。监测了整个脱盐过程的工艺参数以及脱盐前后发酵液的物理化学性质，包括溶液中的盐离子浓度、冻干蛋白粉的灰分含量、蛋白含量和SOD活性。此外，还利用蛋白质组学、非挥发性代谢组学和挥发性代谢组学来评估脱盐效果。
部分摘录
细菌菌株和化学品
本研究中使用的pPIC9K-CuZnSOD重组P. pastoris GS115菌株是在我们实验室构建的，并储存在-80°C [51]。本研究中使用的所有化学品和溶剂均为分析级。发酵培养基和高密度发酵
本研究中使用的FM22培养基基于之前的一项研究进行了略微修改 [5]。在含有30 L FM22培养基的50 L发酵罐中进行了P. pastoris GS115的高密度分批发酵。通过ED和UF-ED对发酵液进行脱盐
比较了ED和UF-ED对发酵液的脱盐效果。脱盐过程中的关键参数变化如图2所示。如图2A所示，UF过程包括两个阶段：第一阶段通过减少体积将发酵液浓缩两次，第二阶段使用5 L纯水反复清洗15次超滤截留液。在第一阶段观察到膜通量逐渐下降。结论
我们探索了结合UF-ED工艺在P. pastoris产生的SOD发酵液中的蛋白质脱盐应用，并通过靶向和非靶向分析系统评估了其脱盐效果。UF-ED在SOD的工业生产中表现出更有效的脱盐效果，并去除了比单独使用ED更多的不需要的代谢物，证明这是一种可行的工艺。本研究还为其他蛋白质的纯化提供了新的见解。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国农业大学2115人才发展计划和贵州省科技计划（KXJZ[2024]017的财政支持。
