《Nature Communications》：Fragmentomic liquid biopsy enables early breast cancer detection, molecular subtyping and lymph node assessment
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为解决现有乳腺癌筛查手段存在可及性、敏感性不足等问题，研究人员开展了一项基于全基因组游离DNA（cfDNA）片段组学特征（包括转录因子结合、重复元件、末端基序等多模态信息）的机器学习模型TuFEst的前瞻性多中心研究。结果显示，该模型在早期癌症检测中实现了高灵敏度（95%）和高特异性（78.3%），并可同时进行非侵入性分子亚型分型（TuFEst-MS）和淋巴结转移预测（TuFEst-LN），为乳腺癌的全面管理提供了一种集成化的液体活检策略。
乳腺癌，一个高悬于全球女性头顶的健康阴云，其早期发现是改善预后的关键。然而，传统的影像学筛查，如钼靶和超声，在现实中遭遇了“双面夹击”：一方面，成像设备在基层医疗机构的可及性有限，导致筛查覆盖面不足；另一方面，对于亚洲女性中常见的致密性乳腺，钼靶的敏感性大打折扣，存在一定的漏诊风险。在中国，数据显示仅有约22.3%的适龄女性接受了乳腺癌筛查，而高达24.1%的患者在确诊时已处于中晚期，显著影响了治疗效果并增加了医疗负担。这些挑战凸显了对一种标准化、不依赖于操作者经验的新型筛查工具的迫切需求。
近年来，液体活检，特别是基于循环游离DNA（cfDNA）的分析，展现出巨大潜力。然而，现有的基于cfDNA突变或甲基化的检测方法在早期癌症检测中各有局限：突变分析因早期肿瘤DNA含量极低而需超高深度测序，成本高昂；甲基化检测则存在DNA损伤、灵敏度有限及计算流程复杂等问题。在此背景下，cfDNA“片段组学”应运而生，它不关注DNA序列本身，而是分析cfDNA在血液中的片段化模式，包括片段大小分布、末端基序、断裂点模式等，这些特征能反映来源细胞的染色质结构和转录活性。这项发表在《自然通讯》（Nature Communications）上的研究，正是将这一前沿理念转化为临床解决方案的一次大规模实践。
为了应对早期乳腺癌检测的挑战，并探索片段组学在分子分型和淋巴结评估中的应用潜力，研究者们开展了一项前瞻性多中心病例对照研究。他们从中国七家医疗机构连续招募了503名经病理确诊的乳腺癌患者和289名良性对照，收集其外周血样本。通过低通量全基因组测序（Low-pass Whole-genome Sequencing, LP-WGS）获取cfDNA片段组学特征，并开发了名为TuFEst（Tumor Fraction Estimator）的机器学习框架。该研究不仅评估了TuFEst区分良恶性的效能，还将其扩展用于分子亚型分类（TuFEst-MS）和淋巴结转移预测（TuFEst-LN）。此外，研究还对79例配对肿瘤组织进行了转录组测序，以解析cfDNA癌症评分背后的生物学意义。
研究涉及几个关键的技术方法：首先是多中心队列的构建与标准化样本处理，所有血样按统一标准操作程序采集、处理和运输，确保了分析前的一致性。核心是低通量（~2×覆盖度）全基因组cfDNA测序与片段组学特征提取，这包括计算全基因组范围内的片段大小分布比值（S/L ratio）、系统量化4碱基对（bp）末端基序和6 bp断裂点基序的频率，以及分析Alu、长末端重复序列（LTR）等重复元件的片段化模式。机器学习模型构建与验证是关键环节，研究者系统比较了包括广义线性模型（GLM）、支持向量机（SVM）、极限梯度提升（XGBoost）和堆叠集成模型（Stacked Ensemble Model, SEM）在内的六种算法，并通过训练集、内部验证集和外部验证集进行严格评估。最后，通过整合染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）公共数据（ReMap 2020数据库）进行转录因子（Transcription Factor, TF）结合位点覆盖度分析，并利用CIBERSORT、xCell、ESTIMATE等算法对配对肿瘤RNA-seq数据进行肿瘤免疫微环境（Tumor Immune Microenvironment）反卷积分析，将cfDNA特征与肿瘤生物学联系起来。
cfDNA片段化反映早期乳腺癌中的转录因子活性
通过对全基因组cfDNA片段化模式的分析，研究者发现，与良性乳腺病变个体稳定一致的片段化图谱相比，乳腺癌患者的cfDNA片段化景观随着肿瘤分期进展而变得越来越紊乱，这种现象在I期肿瘤中即可被检测到。通过将cfDNA片段化特征与ChIP-seq数据整合分析，他们鉴定出146个差异片段化基因组区域，对应844个潜在的转录因子。经过在乳腺癌细胞系（MCF-7和MDA-MB-231）中的验证，最终锁定148个高置信度的转录因子。通路富集分析显示，这些转录因子显著富集于肿瘤发生、内分泌治疗抵抗、雌激素信号传导等关键乳腺癌相关通路。其中，上调的转录因子如FOXA1、AR、RELA（NF-κB亚基）等与肿瘤进展和不良预后相关，而下调的如REST、CREB1等则具有肿瘤抑制功能。这表明cfDNA片段化模式能捕捉驱动早期乳腺癌发生的转录活性程序。
用于乳腺癌检测的TuFEst模型
研究者开发了TuFEst机器学习模型，集成重复元件片段化、定量片段化指数（如N-index, E-index）以及转录因子结合位点覆盖度等多模态特征。在六种算法中，堆叠集成模型（SEM）表现最优，在训练集、内部验证集和外部验证集中均展现出高且稳定的区分性能，曲线下面积（AUC）分别达到0.942、0.937和0.968。模型在外部验证集中实现了91.9%的阳性预测值和93.0%的阴性预测值。特别值得关注的是，在26例影像学评估为可能良性（BI-RADS 3）但后续病理证实为癌的“影像学漏诊”病例中，TuFEst以96.2%的准确率识别出了其中25例早期癌症，凸显了其弥补影像学不足的潜力。
cfDNA片段组学预测乳腺癌分子亚型
乳腺癌的治疗决策高度依赖于基于激素受体和HER2状态的分子分型。为此，研究者开发了TuFEst-MS模型，用于非侵入性预测三种主要分子亚型：ER+/PR+HER2-、HER2+和三阴性乳腺癌（TNBC）。该模型在训练和验证集中对所有亚型均表现出稳健的预测性能，AUC值在0.891至0.939之间。在21例寡转移患者中，TuFEst-MS基于血液预测的亚型与转移灶活检结果的一致性达到85.7%，即使在原发灶与转移灶分子亚型不一致的病例中，也达到了87.5%的准确率，为解决转移灶活检不可及时的治疗决策难题提供了新思路。
用于淋巴结转移检测的cfDNA片段组学
准确评估腋窝淋巴结状态对治疗方案制定至关重要，但现有影像学方法准确性欠佳。研究者开发的TuFEst-LN模型在训练集和验证集中分别取得了0.900和0.874的AUC值，显示出良好的鉴别能力。尽管在主要由早期淋巴结阳性（pN1）患者构成的队列中阳性预测值（PPV）相对中等，但其阴性预测值（NPV）在验证集中高达90.3%。更重要的是，在一个独立的、影像与病理结果不符的挑战性病例集中，模型对于影像学阳性但病理阴性的患者，其排除淋巴结转移的准确率高达97.6%。这表明TuFEst-LN在准确排除淋巴结转移方面具有突出优势，有望支持对临床淋巴结阴性（cN0）患者进行手术降级（如避免前哨淋巴结活检）的决策。
TuFEst癌症评分反映乳腺癌分子亚型侵袭性
分析显示，具有更高侵袭性的HER2阳性型和TNBC亚型的患者，其TuFEst癌症评分显著高于ER+/PR+HER2-亚型患者。这验证了该模型评分与已知的肿瘤侵袭性生物学行为相一致，能够在早期检测阶段即识别出高风险分子亚型。
转录组学分析将TuFEst衍生的癌症评分与乳腺癌生物学相关联
对79例配对肿瘤样本的转录组测序分析发现，癌症评分高的肿瘤表现出更高的免疫细胞浸润水平，特别是活化的细胞毒性免疫细胞（如T细胞、NK细胞、M1型巨噬细胞）。基因集富集分析进一步揭示，高分肿瘤显著富集于上皮-间质转化（EMT）、炎症反应、TNF-α/NF-κB信号通路、E2F靶点、G2M检查点等一系列与肿瘤增殖、转移和免疫微环境重塑相关的 hallmark 通路。相反，低分肿瘤则呈现出“免疫冷”微环境的特征。这从分子层面证实，TuFEst模型捕捉到的cfDNA片段组学特征，深刻反映了肿瘤内在的侵袭性生物学本质和免疫微环境状态。
研究结论与讨论
这项多中心研究证实，基于机器学习整合多维cfDNA片段组学特征的TuFEst模型，是实现乳腺癌早期检测的一种高灵敏度、高特异性的强大工具。其创新性在于，将液体活检的应用从单纯的“有无癌症”检测，成功扩展至分子亚型分型和淋巴结转移预测，实现了“一管血”回答多个关键临床问题的集成化解决方案。
研究的意义深远。首先，它为解决当前乳腺癌筛查，特别是在医疗资源不均地区所面临的挑战提供了新的路径。cfDNA检测对操作者经验依赖小，易于标准化推广，可作为现有影像学筛查的重要补充，特别是用于识别影像学不典型或漏诊的早期病例。其次，TuFEst-MS和TuFEst-LN模型展示了液体活检在乳腺癌精准管理中的巨大潜力：非侵入性分子分型有助于快速指导治疗，尤其是在转移灶活检困难时；高阴性预测值的淋巴结评估模型，则为安全地实施腋窝手术降级、避免患者不必要的创伤和并发症提供了新的决策依据。最后，转录组学关联分析表明，cfDNA片段组学特征并非简单的生物标志物，它们与肿瘤的转录活性、侵袭性生物学行为及免疫微环境密切相关，为理解癌症生物学提供了新的窗口。
当然，研究也存在局限，如导管原位癌（DCIS）样本较少、未评估与特定基因突变（如BRCA1/2）的关联、且目前主要适用于已有影像学发现病灶的人群，在无症状人群筛查中的效能有待前瞻性研究验证。尽管如此，这项工作为基于cfDNA片段组学的乳腺癌综合管理奠定了坚实的证据基础，标志着液体活检向更全面、更精准的癌症诊疗时代迈出了关键一步。
