《Nature Communications》：Tudor domain-containing protein 9-targeting siRNA nanoparticles alleviate Pseudomonas aeruginosa lung injury in preclinical models by promoting neutrophil cuproptosis
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铜绿假单胞菌肺炎治疗挑战严峻，针对致病基因开发新型疗法是关键。本研究聚焦中性粒细胞死亡调控，通过RNA测序筛选出关键基因TDRD9，并构建了一种靶向递送siRNA的透明质酸包被肽纳米颗粒。实验证实，该纳米颗粒可抑制PD-L1/CD80/MAPK信号轴，诱导中性粒细胞发生铜死亡，从而有效减轻小鼠和人源肺类器官的肺部炎症和损伤。该研究为细菌性肺损伤提供了有前景的纳米治疗新策略。
铜绿假单胞菌，一种无处不在、代谢多样的革兰阴性菌，是免疫受损人群中最主要的条件致病菌。由其引发的肺炎、呼吸道感染、败血症等问题，在全球范围内造成了巨大的发病率和死亡率。更棘手的是，铜绿假单胞菌能够通过分泌毒力因子、形成生物膜等策略逃避宿主免疫防御，加之近年来多重耐药菌株的流行，使得临床治疗面临严峻挑战。因此，开发新的辅助治疗策略来减轻感染相关的发病率，已成为一个紧迫的优先事项。
在感染过程中，中性粒细胞作为首先被募集到感染部位的主要免疫效应细胞，在清除细菌和协调免疫应答中扮演着核心角色。然而，越来越多的证据表明，中性粒细胞功能失调会加剧宿主对侵袭性感染的易感性。铜绿假单胞菌能够通过诱导NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成）、细胞焦亡等多种程序性细胞死亡方式来调控中性粒细胞的命运。近年来，一种名为“铜死亡”的新型铜依赖性程序性细胞死亡途径被揭示，它与线粒体代谢紊乱相关，并在多种疾病中被研究，但其在铜绿假单胞菌感染发病机制中的作用仍然未知。
另一方面，基于RNA干扰的疗法在肺炎治疗中展现出巨大潜力，而纳米颗粒是递送小干扰RNA（siRNA）的强大载体。它们不仅能解决裸RNA药物血浆半衰期短、细胞摄取效率低等固有局限，其本身还具有固有的抗菌特性。然而，siRNA纳米颗粒在铜绿假单胞菌诱导的肺部感染期间，对中性粒细胞的特异性调节功能仍不清楚。
为了填补这一空白，研究人员开展了一项深入的研究，并将成果发表在了国际顶级期刊《Nature Communications》上。他们究竟是如何破译致病基因、并设计出精准的纳米“导弹”来对抗铜绿假单胞菌肺炎的呢？
关键技术方法
本研究综合运用了临床样本分析、动物模型、细胞实验、纳米技术和类器官模型。研究队列包括21名患者的支气管肺泡灌洗液来源的中性粒细胞，用于RNA测序筛选关键基因。体内实验采用铜绿假单胞菌菌株PAO1经气道感染C57BL/6小鼠构建肺炎模型。体外机制研究使用人外周血中性粒细胞，并利用铜离子载体Elesclomol诱导铜死亡。核心治疗工具是自主研发的、由透明质酸包被的p5RHH肽纳米颗粒，用于靶向递送靶向TDRD9的siRNA。研究还建立了源自患者肺组织的人源肺类器官模型，用于验证纳米颗粒的疗效。
研究结果
TDRD9在PA诱导的肺炎患者中表达上调
研究人员对来自对照组、非PA肺炎和PA肺炎患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）来源的中性粒细胞进行了RNA测序。比较分析发现，PA肺炎患者的中性粒细胞中，Tudor结构域蛋白9（TDRD9）的表达显著上调。随后的qRT-PCR验证也确认了这一点，表明TDRD9的上调与PA肺炎的发生发展相关。
中性粒细胞TDRD9对减轻小鼠感染后肺炎至关重要
在小鼠模型中，PAO1感染诱导了进行性的体重下降、肺部细菌负荷增加、肺水肿以及显著的中性粒细胞炎症。值得注意的是，PAO1感染上调了肺中性粒细胞中TDRD9的表达。机制上，PAO1感染抑制了中性粒细胞的凋亡、细胞焦亡、铁死亡等多种死亡途径，但独特地抑制了铜死亡。感染的中性粒细胞表现出铜死亡相关蛋白（如DLAT、FDX1）的上调。通过使用抗Ly6G抗体清除中性粒细胞，随后过继转移经过TDRD9敲低的中性粒细胞，可以显著减轻PAO1驱动的病理变化，包括降低细菌负荷、缓解水肿、减少中性粒细胞浸润等。这些发现确立了TDRD9是PA感染期间调节中性粒细胞铜死亡和肺损伤的关键因子。
TDRD9敲低增强人中性粒细胞的铜死亡
在体外，使用铜离子载体Elesclomol（ES）可诱导人中性粒细胞发生铜死亡并降低细胞活力。PAO1感染会上调TDRD9的表达，并且TDRD9的表达水平与多种促铜死亡蛋白（DLAT, FDX1等）呈正相关，与抗铜死亡蛋白（SLC31A1, p53）呈负相关，提示TDRD9是铜死亡的负调控因子。功能实验证实，TDRD9敲低会降低中性粒细胞活力，这种效应可被铜死亡抑制剂四硫代钼酸盐部分挽救，但不受其他细胞死亡途径抑制剂的影响，表明TDRD9缺失特异性地触发了中性粒细胞铜死亡。
RNA测序鉴定PD-L1/CD80/MAPK为关键的TDRD9相关信号节点
为了阐明TDRD9调控中性粒细胞铜死亡的机制，研究人员对经过TDRD9敲低并暴露于PAO1的人中性粒细胞进行了RNA测序。分析发现，程序性死亡配体1（PD-L1，由CD274编码）是TDRD9敲低中性粒细胞中下调的候选基因。基因本体富集分析显示，差异表达基因显著富集在MAPK级联的正调控等通路。蛋白质-蛋白质相互作用网络进一步确定PD-L1与CD80相互作用，而MAPK信号通路本身可通过调控FDX1来调节铜死亡。这些数据将PD-L1/CD80/MAPK轴定位为TDRD9在PA感染期间调控中性粒细胞铜死亡的核心通路。
TDRD9通过PD-L1/CD80/MAPK信号轴调控中性粒细胞铜死亡
功能验证实验表明，PAO1/ES联合暴露会上调TDRD9、PD-L1、CD80和磷酸化p38 MAPK（p-p38）的水平，而TDRD9敲低则抑制了这些标志物。挽救实验证明，在TDRD9敲低的中性粒细胞中过表达PD-L1，可以恢复PD-L1/CD80/p-p38的水平，挽救TDRD9敲低导致的细胞活力丧失，并逆转铜死亡相关蛋白的表达变化。进一步机制剖析发现，PD-L1过表达会上调PD-L1、CD80和p-p38，而CD80敲低则消除了这些效应。免疫共沉淀证实了PD-L1和CD80之间存在直接的相互作用。使用MAPK激动剂U-46199可以模拟PD-L1过表达的效果。这些发现共同确认了PD-L1/CD80/MAPK是TDRD9介导的铜死亡调控的核心通路。
HA-si-TDRD9 NPs的合成与功能验证
研究人员合成了由透明质酸（HA）包被的自组装siRNA纳米颗粒（HA-si-TDRD9 NPs），其平均流体动力学直径约为330纳米，形态均匀。功能评估显示，HA包被显著增强了纳米颗粒被中性粒细胞的摄取。与未包被的纳米颗粒相比，HA-si-TDRD9 NPs能在中性粒细胞中实现更有效的TDRD9基因敲低。
HA-si-TDRD9 NPs通过PD-L1/CD80/MAPK信号增强中性粒细胞铜死亡
在PAO1和ES共处理的中性粒细胞中，HA-si-TDRD9 NPs能够抑制TDRD9的表达，并相应地下调PD-L1、CD80和p-p38。这种抑制与PAO1/ES协同作用，加剧了中性粒细胞活力的丧失并诱导了铜死亡。进一步的实验表明，PD-L1的过表达可以逆转HA-si-TDRD9 NPs驱动的细胞活力丧失和铜死亡诱导，而p38抑制剂SB203580则可以抵消PD-L1过表达的保护效应。这些数据确立了HA-si-TDRD9 NPs是通过使PD-L1/CD80/MAPK失活来诱导PA感染期间中性粒细胞铜死亡的有效诱导剂。
HA-si-TDRD9 NPs减轻PA诱导的肺损伤
在体内，对PAO1感染的小鼠静脉注射低剂量（0.1 μmol）或高剂量（0.2 μmol）的HA-si-TDRD9 NPs，可以显著减轻肺部细菌负荷、肺水肿、炎症细胞因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）水平以及肺组织炎症浸润。从肺组织分离的中性粒细胞显示，HA-si-TDRD9 NPs下调了TDRD9、PD-L1、CD80、p-p38以及多种铜死亡相关蛋白的表达。高剂量NPs显示出更优的治疗效果，且未观察到明显的肝肾毒性。
HA-si-TDRD9 NPs降低人肺类器官对PA感染的易感性
研究人员利用患者来源的邻近非癌肺组织成功培育了3D人肺类器官。PA攻击会破坏类器官结构，而HA-si-TDRD9 NPs处理则可以减轻这种损伤。在类器官模型中，HA-si-TDRD9 NPs显著抑制了细菌增殖，下调了PA触发的TDRD9、PD-L1、CD80和p-p38表达，减少了PA诱导的细胞凋亡和炎症因子水平。这些数据表明HA-si-TDRD9 NPs能够减轻人肺类器官对PA感染的易感性。
结论与讨论
这项研究系统性地揭示了一个全新的治疗铜绿假单胞菌肺炎的靶点与策略。通过临床样本测序，研究人员锁定TDRD9是PA肺炎中中性粒细胞的关键致病基因。深入机制研究发现，TDRD9通过激活PD-L1/CD80/MAPK信号轴来抑制中性粒细胞的铜死亡，从而延长了中性粒细胞的炎症状态，加剧了肺损伤。基于此，研究团队创新性地设计并合成了靶向递送TDRD9 siRNA的透明质酸包被纳米颗粒。
该纳米颗粒疗法展现出了多方面的优势：其一，精准靶向，利用HA与中性粒细胞表面CD44的结合实现特异性递送；其二，机制新颖，通过诱导一种相对“冷门”的细胞死亡方式——铜死亡，来清除病理状态下的中性粒细胞，从而缓解炎症，而非传统意义上的抗菌或直接抗炎；其三，疗效显著，在动物模型和人源肺类器官中均证实了其减轻细菌负荷、肺水肿和组织损伤的强大能力；其四，转化潜力大，整合了基因沉默、纳米技术和类器官模型，为未来的临床转化提供了扎实的临床前研究基础。
尽管研究存在一些局限性，如队列规模、缺乏中性粒细胞特异性敲除小鼠模型等，但其发现无疑为治疗细菌性肺损伤，尤其是耐药菌感染，开辟了一条充满希望的新途径。这项研究不仅深化了我们对感染过程中中性粒细胞命运调控的理解，更重要的是，它展示了一种将基础研究发现转化为潜在治疗工具的完整范例，即“临床问题-基因发现-机制阐释-纳米药物开发-多模型验证”的研究闭环。靶向TDRD9的HA-si-TDRD9 NPs有望成为一种有前景的辅助治疗策略，用于管理铜绿假单胞菌等引起的肺炎相关免疫病理，为恢复感染状态下的中性粒细胞稳态提供了精准的靶向方案。
