《Antioxidants》：Immune-Enhancement Effects of 6-Methoxykaempferol on Cyclophosphamide-Induced Immunosuppression via Improving Antioxidant Enzyme Expression, NF-κB and MAPK Signaling, and Modulating Gut Microbiome
Na-Yeon Jang,
Varun Jaiswal,
Miey Park and
Hae-Jeung Lee
编辑推荐：
本研究发现源自甜樱桃的黄酮类化合物6-甲氧基山奈酚（6MK）在环磷酰胺（CPA）诱导的免疫抑制小鼠模型中展现出显著的免疫增强活性。6MK通过恢复免疫器官（脾脏、胸腺）结构与功能、提升自然杀伤（NK）细胞活性、促进T/B淋巴细胞增殖、调节促炎/抗炎细胞因子水平、提高免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）及一氧化氮（NO）浓度，从而逆转免疫抑制状态。其分子机制涉及上调抗氧化酶（CAT、HO-1、SOD）表达、再激活被抑制的NF-κB和MAPK信号通路，并可能通过与Toll样受体4/髓样分化因子2受体复合物（TLR4/MD2）相互作用实现。此外，6MK还能通过调节肠道菌群（如增加α多样性、促进Dorea longicatena丰度、上调甲醛代谢通路）来辅助免疫增强。该研究首次在体内证实了6MK的免疫调节潜力，为开发靶向免疫相关疾病的功能性食品或补充剂提供了新的候选分子。
1. 引言
免疫系统通过协调先天性和适应性反应维持机体稳态，其失衡会增加对疾病的易感性。6-甲氧基山奈酚（6MK）是一种存在于甜樱桃等植物中的甲氧基化黄酮醇，其潜在的免疫调节作用尚未在体内得到充分研究。本研究旨在利用环磷酰胺（CPA）诱导的免疫抑制小鼠模型，探究6MK的免疫增强活性及其潜在机制。CPA是一种广泛使用的烷化剂，具有抗肿瘤和免疫抑制特性，常用于建立免疫缺陷小鼠模型。研究重点关注了6MK对核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）这两个免疫调节关键信号通路中关键蛋白表达的影响。此外，研究还通过分子对接分析了6MK与Toll样受体4/髓样分化因子2受体复合物（TLR4/MD2）的可能相互作用，该复合物可通过激活上述通路刺激免疫反应。鉴于类黄酮对肠道菌群的益生元功能及其通过肠-免疫轴对健康（包括免疫增强）的促进作用，本研究也探讨了6MK对肠道菌群的影响。
2. 材料与方法
2.1. 材料
6MK购自中国南京的安吉恩国际有限公司。抗体及其他生化试剂购自ABclonal、Abcam、Cell Signaling Technology、Santa Cruz Biotechnology等公司。
2.2. 实验动物与设计
将5周龄雄性BALB/c小鼠随机分为四组（每组n=10）：正常对照组（NC）、环磷酰胺对照组（CP）、CPA + 6MK 10 mg/kg/天组（6MK_10）和CPA + 6MK 25 mg/kg/天组（6MK_25）。除NC组外，其余组小鼠在第1天和第3天腹腔注射CPA（100 mg/kg）诱导免疫抑制。6MK通过口服给药。实验结束后收集血液、脾脏和胸腺等组织样本进行分析。
2.3. 检测指标
实验期间监测小鼠体重变化，计算胸腺和脾脏指数。通过苏木精-伊红（H&E）染色评估脾脏和胸腺的组织病理学变化。检测外周血中自然杀伤（NK）细胞活性（通过IFN-γ分泌衡量）和脾淋巴细胞增殖（经Con A和LPS刺激）。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中一氧化氮（NO）、细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、TGF-β）和免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）的水平。通过蛋白质印迹法（Western blot）分析脾组织中抗氧化酶（CAT、HO-1、SOD、Nrf2）以及NF-κB和MAPK通路关键蛋白（p-NF-κB、p-IκBα、p-JNK、p-ERK、p-p38）的表达。使用AutoDock 4.2进行分子对接模拟，分析6MK与TLR4/MD2复合物的结合。对小鼠粪便进行16S rRNA基因测序，分析肠道菌群组成和功能。
3. 结果
3.1. 6MK对免疫器官、体重及组织形态的影响
CPA处理导致小鼠体重下降，脾脏和胸腺指数异常，脾脏出现红白髓界限不清，胸腺皮质萎缩。6MK治疗显著恢复了小鼠的体重，改善了脾脏和胸腺指数，并逆转了这些免疫器官的组织结构损伤，使其接近正常状态。
3.2. 6MK对免疫细胞功能的影响
CPA显著抑制了NK细胞活性（IFN-γ分泌减少）以及T细胞和B细胞的增殖能力。6MK处理显著恢复了NK细胞的活性，并增强了经Con A和LPS刺激的脾淋巴细胞增殖，表明其能改善细胞免疫和体液免疫功能。
3.3. 6MK对血清免疫分子水平的影响
CPA降低了血清中NO、促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、抗炎细胞因子（IL-4、IL-10、TGF-β）以及免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）的水平。6MK治疗显著提升了所有这些免疫相关分子的血清浓度。
3.4. 6MK对抗氧化防御系统的影响
CPA处理下调了脾脏中抗氧化酶CAT、HO-1、SOD及其上游转录因子Nrf2的蛋白表达。6MK治疗显著上调了这些酶和转录因子的表达，表明其具有增强抗氧化防御的能力。
3.5. 6MK对免疫信号通路的影响
蛋白质印迹分析显示，CPA抑制了脾脏中MAPK通路关键蛋白（p-JNK、p-ERK、p-p38）和NF-κB通路关键蛋白（p-NF-κB、p-IκBα）的磷酸化。6MK处理显著恢复了这些蛋白的磷酸化水平，表明其能重新激活在免疫抑制状态下被压制的NF-κB和MAPK信号通路。
3.6. 分子对接分析
分子对接模拟表明，6MK能够结合到TLR4/MD2复合物的配体结合口袋，其估计结合自由能为-7.20 kcal/mol，与已知的TLR4/MD2激动剂euodenine A（-8.22 kcal/mol）相近。相互作用分析显示，6MK与TLR4/MD2之间形成了12个疏水相互作用和1个氢键，提示6MK可能作为TLR4/MD2的潜在激动剂，从而启动下游的NF-κB和MAPK信号通路。
3.7. 6MK对肠道菌群的影响
肠道菌群分析显示，与CPA组相比，6MK处理组小鼠的肠道菌群α多样性（Faith系统发育多样性）显著增加，但β多样性无显著变化。差异丰度分析发现，6MK处理增加了细菌物种Dorea longicatena的丰度，该菌可产生具有免疫调节功能的短链脂肪酸（如丁酸盐）。此外，功能预测分析表明，6MK处理上调了肠道菌群中的“甲醛氧化I”和“甲醛同化II（RuMP循环）”通路，这些通路上调可能有助于消耗具有免疫抑制作用的甲醛。
4. 讨论
本研究首次在体内综合评估了6MK对CPA诱导的免疫抑制的改善作用。6MK通过多靶点、多途径发挥免疫增强效应。在器官和组织层面，它修复了受损的免疫器官结构。在细胞层面，它增强了NK细胞、T细胞和B细胞的功能。在分子层面，它提升了关键免疫介质（细胞因子、抗体、NO）的水平，并增强了机体的抗氧化防御能力。其核心分子机制可能在于通过潜在激动TLR4/MD2受体，进而重新激活下游的NF-κB和MAPK信号通路，这两个通路是协调炎症与免疫反应的核心调控网络。此外，6MK对肠道菌群的有益调节，包括增加菌群多样性、促进有益菌D. longicatena生长以及上调甲醛消耗通路，可能通过肠-免疫轴协同贡献于全身免疫功能的增强。这些发现为6MK作为一种具有潜力的天然免疫增强剂提供了坚实的实验依据。未来的研究需要进一步验证6MK与TLR4/MD2的确切相互作用，并在包括雌性动物在内的更复杂模型以及人类外周血单核细胞（PBMCs）中验证其效果，同时进行系统的药代动力学和安全性评价，以推动其向临床应用发展。
5. 结论
本研究证实，甜樱桃来源的黄酮类化合物6-甲氧基山奈酚（6MK）能显著改善环磷酰胺诱导的免疫抑制。其作用体现在恢复免疫器官功能、增强免疫细胞活性、提高免疫分子水平、激活抗氧化防御以及再激活关键的NF-κB和MAPK信号通路。对肠道菌群的有益调节也参与了其免疫增强作用。这些结果凸显了6MK作为天然免疫调节剂用于预防或缓解免疫抑制相关疾病的潜在价值。
