痰液谷氧还蛋白1与蛋白质S-谷胱甘肽化在慢阻肺中的作用

《Antioxidants》：Sputum Glutaredoxin 1 and Protein S-Glutathionylation in COPD Ine Kuipers, Renske Krijgsman, Renaud Louis, Jean-Louis Corhay, Thibault Azevedo Mendes, Guy G. Brusselle, Ken R. Bracke and Niki L. Reynaert

本文综述探讨了在慢性阻塞性肺病（COPD）中，痰液内谷氧还蛋白1（Grx1）活性增强与蛋白质S-谷胱甘肽化（PSSG）水平变化之间的关联，揭示了该氧化还原轴在COPD急性加重期失衡，并与肺功能下降、炎症水平升高密切相关，为理解慢阻肺发病机制和寻找潜在干预靶点提供了新视角。

引言

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是全球第三大致死原因，其特征是小气道异常和/或肺气肿，导致不可逆的气流受限及咳嗽、呼吸困难等症状。疾病的周期性加重会显著加速疾病进展并降低生活质量。吸烟是COPD最重要的风险因素，其产生的过量自由基和内源性氧化剂会导致慢性炎症，压倒肺部的抗氧化防御系统，从而引发氧化应激和组织损伤。谷胱甘肽（GSH）是肺部最重要的抗氧化防御成分。GSH可逆性地与蛋白质巯基共价结合，形成混合二硫键，这一可逆的翻译后修饰称为蛋白质S-谷胱甘肽化（PSSG）。PSSG不仅保护蛋白质巯基免于不可逆氧化，还能调节蛋白质功能，影响细胞信号通路。谷氧还蛋白（Grx），特别是其最佳表征的亚型Grx1，是逆转PSSG的关键氧化还原酶。尽管对COPD中GSH/GSSG失衡的研究已很深入，但Grx1-PSSG轴的作用仍不明确。本研究的目的是探讨COPD患者诱导痰中Grx1-PSSG轴的变化及其与肺功能和炎症指标的相关性，并在动物模型和细胞培养中研究Grx1的分泌机制。

材料与方法

研究收集了16名稳定期COPD患者、14名急性加重期COPD患者（第1或2天）和25名健康对照者的诱导痰样本。通过蛋白质印迹法检测痰液中Grx1蛋白水平，通过分光光度法测定总Grx活性，并使用5,5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）法测定痰液中PSSG水平。利用酶联免疫吸附法检测支气管肺泡灌洗液（BALF）和细胞培养上清中的Grx1水平。通过定量聚合酶链式反应（qPCR）检测基因表达。统计分析采用SPSS软件，使用非参数检验等方法，p值<0.05被认为具有统计学意义。

研究结果

3.1. COPD患者诱导痰中Grx1-PSSG轴的生化评估

与健康非吸烟者相比，健康吸烟者的痰液中Grx1蛋白水平升高；与稳定期COPD患者相比，急性加重期患者的痰液中Grx1蛋白水平也显著升高。值得注意的是，在所有加重期患者的痰液中观察到了一个额外的低分子量条带。Grx活性的变化与Grx1蛋白水平的变化一致，在健康吸烟者中高于非吸烟者，在加重期患者中高于稳定期患者。相反，急性加重期患者痰液中的PSSG水平显著低于稳定期患者。重要的是，在整个研究人群中，PSSG水平与Grx1蛋白水平及总Grx活性均呈显著负相关。

3.2. 诱导痰中Grx1-PSSG轴的相关性分析

在整个研究人群中，Grx1蛋白水平和Grx活性与吸烟包年数呈显著正相关，而PSSG水平与吸烟包年数呈负相关。在肺功能方面，PSSG水平与FEV₁%预计值、FVC%预计值以及FEV₁/FVC比值呈正相关。相反，Grx1蛋白水平与FVC%预计值及FEV₁/FVC比值呈负相关。在与炎症指标的关系上，痰液PSSG水平与巨噬细胞百分比呈正相关，与中性粒细胞百分比呈负相关，并且与促炎细胞因子IL-1β和IL-8的浓度呈负相关。而Grx1蛋白水平则与IL-1β和IL-8呈正相关。

3.3. COPD小鼠模型BALF中的Grx1

与人体观察结果一致，长期暴露于香烟烟雾四周的小鼠，其支气管肺泡灌洗液（BALF）中的Grx1蛋白水平显著高于暴露于空气的对照组小鼠。此外，在过表达人TNFα的SPC-TNFα慢性肺部炎症小鼠模型中，其BALF中的Grx1蛋白水平、肺组织中的Grx1 mRNA和蛋白水平均显著高于野生型对照小鼠。免疫组化显示，在烟雾暴露和SPC-TNFα小鼠的肺泡巨噬细胞和上皮细胞中，Grx1染色增强。

3.4. 巨噬细胞和上皮细胞在香烟烟雾和炎症介质刺激下Grx1的上调和释放

体外实验表明，用香烟烟雾提取物（CSE）处理J774.1巨噬细胞系24小时，能以剂量依赖的方式上调Grx1的mRNA表达，并显著增加细胞内Grx1蛋白水平和细胞培养上清中的Grx1含量。用炎症介质脂多糖（LPS）和佛波酯（PMA）刺激也能增强J774.1细胞中Grx1的表达和释放。在人支气管上皮细胞H292中，PMA和TNFα刺激同样能上调Grx1的mRNA和蛋白表达，并促进Grx1释放到培养基中，且其释放量随时间（72小时内）逐渐累积。

3.5. 细胞外Grx1的摄取及其对巨噬细胞MMP表达的影响

用重组Grx1处理J774.1巨噬细胞，可显著增加基质金属蛋白酶（MMP）8、9、12和13的表达。同时，暴露于重组Grx1会导致巨噬细胞内Grx1蛋白水平升高，表明巨噬细胞能够摄取完整的Grx1。此外，在_Glrx1基因敲除小鼠中，MMP12的基础表达减弱，并且_Glrx1的缺失在很大程度上阻止了香烟烟雾暴露引起的MMP12表达增加。

讨论

本研究证实，在COPD急性加重期，痰液中的Grx1-PSSG轴发生显著改变。痰液Grx1水平与吸烟暴露和炎症呈正相关，与肺功能呈负相关。相反，PSSG水平则表现出相反的相关性，与吸烟和炎症呈负相关，与肺功能呈正相关。在两种互补的COPD动物模型中，均观察到支气管肺泡灌洗液中Grx1水平升高，并且在CSE和炎症介质刺激下，巨噬细胞可释放Grx1到细胞培养基中。最后，研究证明Grx1能够调节巨噬细胞和肺组织中MMPs的表达。

Grx1水平的升高可能与吸烟和炎症刺激有关，巨噬细胞和上皮细胞是潜在的分泌来源。尽管巨噬细胞比例在吸烟者和COPD患者中趋于减少，但上皮细胞在急性炎症期间可能是细胞外Grx1的重要来源，因为炎症介质可触发上皮细胞释放Grx1。Grx1蛋白水平升高的同时伴有总Grx活性的增加，而PSSG水平在加重期则降低，这与Grx去除蛋白质上GSH的功能一致。急性加重期观察到的Grx1免疫反应性出现低于预期分子量的条带，可能代表了Grx1的降解产物。

PSSG可被视为GSH的储备库，Grx1可将其释放以增强细胞和组织的抗氧化潜力。加重期痰液中PSSG水平降低和Grx1活性增强的组合，可能代表了对升高氧化应激的一种适应性反应，旨在动员蛋白质中的GSH。PSSG与肺功能参数的正相关关系支持其保护功能。PSSG水平与中性粒细胞百分比和吸烟包年数的负相关，可能反映了中性粒细胞和烟雾引发的氧化性蛋白质损伤。此外，Grx1通过催化蛋白质去谷胱甘肽化来调节多种蛋白质的功能，从而对细胞信号传导进行氧化还原控制。研究发现，痰液Grx1蛋白水平与肺功能参数呈负相关，提示释放到细胞外环境中的Grx1可能通过调节PSSG来促进与加重相关的疾病进展和肺功能恶化。在巨噬细胞内，Grx1和PSSG调节着对其功能至关重要的一系列过程，包括分化和极化、细胞代谢、炎症介质的产生以及本研究证实的MMPs表达。

结论

本研究强调了Grx1-PSSG氧化还原轴在COPD，尤其是急性加重期的潜在重要性。痰液中Grx1水平升高和PSSG水平降低，与肺功能下降和炎症加剧相关，表明该轴可能在疾病进展中扮演重要角色。未来的研究需要更详细地探讨细胞外Grx1与肺功能和炎症之间复杂的关系，并考虑不同COPD表型和患者异质性，以期为COPD的病理机制理解和治疗靶点发现提供新方向。