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这篇研究性论文（非综述）报道了一种新型分子工具的开发与应用。研究者构建了一系列高亲和力的载脂蛋白E（apoE）特异性单域抗体（纳米抗体），实现了对阿尔茨海默病（AD）关键风险因子apoE4在细胞内（如内质网）和胞质中的探测与操控，为深入解析apoE4在AD病理中的分子机制提供了有力工具。
1. 引言
载脂蛋白E（apoE）是中枢神经系统中主要的脂质和胆固醇载体蛋白。人类APOE基因有三种常见等位基因，其中APOE-ε4是晚发型阿尔茨海默病（AD）最强的遗传风险因素。尽管apoE4与AD的多种病理过程相关，但其在分子水平上的作用机制仍未完全阐明。目前，直接在蛋白水平上研究apoE4的工具十分有限。纳米抗体（Nbs）是一种源自骆驼科动物重链抗体的单域抗体，具有体积小、亲和力高、稳定性好等优点，并且能够作为胞内抗体在活细胞内直接操控靶蛋白，这使其成为在细胞环境中研究apoE4的理想工具。
2. 材料与方法
研究通过免疫羊驼，并针对人重组apoE4、apoE3、合成apoE4肽段或其组合构建了四个纳米抗体噬菌体展示库。经过生物淘选，获得了一系列apoE特异性纳米抗体。通过共免疫沉淀、生物层干涉技术（BLI）分析了这些抗体与重组apoE蛋白的结合能力和动力学。利用分子克隆技术构建了用于细菌和哺乳动物细胞表达的各类质粒，包括靶向内质网的纳米抗体（SEC2-Nb-HA-KDEL）和用于胞质定位的apoE4变体（apoE4(ΔSEC1)）等。实验在HEK293T、SH-SY5Y等细胞系中进行，通过免疫细胞化学、共免疫沉淀、蛋白质印迹等技术，验证了纳米抗体在细胞内与apoE4的相互作用及功能。
3. 结果
3.1. ApoE纳米抗体以高亲和力结合重组ApoE4和ApoE3
从四个文库中筛选出的15个代表性纳米抗体均能结合重组apoE4和apoE3。BLI动力学分析显示，大多数纳米抗体的平衡解离常数（Kd）在低纳摩尔甚至亚纳摩尔范围，表明具有高亲和力。基于结合结果，后续选择了6个纳米抗体（9-8, 9-74, 17-69, 18-27, 18-91, 19-38）进行深入表征。
3.2. 六个选定的ApoE纳米抗体结合HEK293T细胞分泌的ApoE4
这6个纳米抗体不仅识别细菌表达的重组apoE，也能通过共免疫沉淀检测到由哺乳动物细胞HEK293T表达并分泌到培养基中的全长apoE4，证明了其与天然蛋白的结合能力。
3.3. 结构域水平的表位作图：选定的纳米抗体分别结合ApoE4的N端或C端片段
apoE蛋白包含由铰链区连接的两个主要结构域：N端结构域（含受体结合区）和C端结构域（含脂质结合区）。研究制备了对应的两个apoE4片段（aa1-173和aa170-299）。共免疫沉淀实验表明，6个纳米抗体分为两组：纳米抗体9-74和19-38特异性结合N端片段，而纳米抗体9-8, 17-69, 18-27和18-91则结合C端片段。这定义了一组具有结构域选择性的纳米抗体工具。
3.4. 四个选定的ApoE纳米抗体在靶向内质网时具有功能
为了探究纳米抗体能否作为细胞内工具，研究者将选定的两个N端结合体（9-74, 19-38）和两个C端结合体（17-69, 18-91）构建为内质网靶向的胞内抗体（SEC2-Nb-HA-KDEL）。当在HEK293T细胞中共表达这些内质网靶向纳米抗体和apoE4时，免疫荧光显示两者显著共定位，皮尔逊相关系数（PCC）值显著高于0.5。共免疫沉淀进一步证实了它们在细胞内的相互作用。更重要的是，与表达靶向GFP的纳米抗体对照相比，表达这些apoE纳米抗体导致细胞内apoE4水平升高，而分泌到培养基中的apoE4减少，表明纳米抗体成功在分泌途径中与apoE4结合并促进了其胞内滞留。
3.5. 胞质ApoE4(ΔSEC1)定位于核周组装体，与~25 kDa片段相关，且不能被NLS标记的纳米抗体重新定位至细胞核
有研究表明apoE4片段可能在胞质中影响线粒体功能等过程。为了探索胞质apoE4的行为，研究表达了缺失分泌信号肽的胞质apoE4变体（apoE4(ΔSEC1)）。在HEK293T和SH-SY5Y细胞中，该蛋白在核周区域富集形成组装体，并与可检测蛋白聚集的染料ProteoStat部分共定位，提示其具有类聚集特性。蛋白质印迹分析发现，表达胞质apoE4的细胞中出现了一个约25 kDa的额外条带，这可能在分泌途径表达的apoE4中未观察到，提示胞质定位可能使apoE4更易发生蛋白水解加工。
为了测试胞质apoE4是否能被纳米抗体结合并操控，研究者构建了融合有SV40大T抗原核定位信号（NLS）的纳米抗体17-69（NLS-Nb17-69-mCherry）。共免疫沉淀证实该纳米抗体能在细胞内结合apoE4(ΔSEC1)。然而，当两者共表达时，尽管单独的NLS纳米抗体强效定位于细胞核，但apoE4(ΔSEC1)并未被重新定位至核内，两者均停留在胞质中。这表明结合了纳米抗体的胞质apoE4复合体不具备核输入能力，可能与观察到的其聚集倾向有关。
4. 讨论
本研究成功开发了一套靶向apoE的纳米抗体工具箱，这些抗体具有高亲和力和结构域选择性。它们能被设计为功能性的内质网靶向胞内抗体，在分泌途径中结合并滞留apoE4，为在疾病相关细胞模型（如携带APOE-ε4的iPSC衍生神经元）中操纵apoE4并研究其下游效应提供了新的研究工具。此外，作为工具箱的探索性应用，研究初步描绘了胞质apoE4的行为：它倾向于形成核周聚集，并可能产生特征性的蛋白水解片段。这些发现与apoE4在AD脑中更不稳定、易被切割的报道相符。未来，利用此纳米抗体工具箱进一步研究apoE4在不同细胞区室中的生物学，将有助于更深入地理解其在阿尔茨海默病发病机制中的作用。
