《Microplastics》：Establishing a Microfiber Recovery Rate in Human Lung Tissue
Kylie Babin-Howard,
Kara Coffman-Rea and
Karen E. Samonds
1. 引言
1.1. 塑料与微塑料污染
塑料已成为我们星球上无处不在的一部分，自其大规模生产开始以来的不到一个世纪里，塑料污染呈指数级增长。据估计，自20世纪50年代以来，已生产了约83亿吨塑料，并产生了约63亿吨塑料废物。其中，9%被回收，12%被焚烧，约79%积累在垃圾填埋场或自然环境中。塑料已被确立为水生和陆地环境的主要污染源之一。最常见生产和使用的聚合物类型是聚乙烯（PE）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚丙烯（PP）、聚苯乙烯（PS）、聚氯乙烯（PVC）和聚氨酯（PU）。此外，这些聚合物类型中大部分用于一次性产品，其稳定性和长降解时间导致其在环境中积累。
1.2. 人类对微塑料的暴露
塑料随时间的降解和风化会导致微塑料（MPs，粒径小于5 mm）的产生。大量研究发现环境中存在MP污染，包括海洋和淡水生态系统、土壤、灰尘、降水以及空气中悬浮的MPs。MP污染的负面影响在所有研究的环境中都很明显。MPs通常含有多种添加剂，这些添加剂可能浸出，将潜在有害的化学物质引入环境。这引发了人们对人类健康的担忧，因为MPs也出现在我们的食物和水中、我们呼吸的空气中以及个人护理产品中。因此，MPs在我们生活中的普遍存在引发了大量在人体内检测MPs的研究，例如在粪便、肺、血液、心脏组织、胎盘、母乳、肝脏和脑组织中检测到MPs。MP进入人体的方式包括摄入、吸入和皮肤接触。关于MP在人体内积累的研究仍然有限，MP对人体系统的健康影响尚未完全明了。然而，使用暴露模型的实验研究表明存在不良健康影响，并显示MPs可导致细胞形态和增殖的改变。
1.3. 微塑料的分类与物理形态
根据来源，MPs可分为原生和次生。原生MPs是生产时即为小颗粒，旨在用于个人护理产品或纺织品。次生MPs源于较大塑料产品的风化和降解。MP颗粒通常按聚合物类型、尺寸和形状进行分类。对于MP形状尚无标准化的命名系统；然而，片段（例如，不规则、锯齿状）、泡沫（例如，薄、透明、柔软）、颗粒/球体（例如，圆形结构）和纤维（例如，细长的线状结构）是常用分类。另一个用于形状分类的系统是将长宽比至少为3:1的MPs定义为“微纤维”（MFs），而其他所有MPs定义为“颗粒”。这些分类有助于识别和比较MPs及其可能的来源。
物理特征的标示对分类很重要，因为不同形态的MPs根据其类型、尺寸和形状显示出或多或少的危害性。与颗粒相比，MFs已被证明毒性更高。此外，据报道，MFs比颗粒更普遍，因为它们从日常物品（如服装、家具装饰、地毯和洗衣）中脱落。环境报告显示，MFs的发生率是颗粒的两倍多。然而，大多数实验研究使用MP颗粒，这些颗粒可以方便地购买特定尺寸、类型和颜色，导致我们对MFs的了解存在差距，尽管它们在我们的日常生活中非常普遍。
1.4. 微塑料的化学分析
MFs具有高度可变性，从其组成的聚合物材料类型，到生产过程中有意添加或从环境中积累的化学物质。许多生产过程中添加的化学物质已知是有害的，从致癌物到内分泌干扰物不等。一旦MFs进入环境，这些化学物质就有可能浸出。MFs还可以吸附和运输有毒化学物质，如重金属、多氯联苯（PCBs）和多环芳烃（PAHs），充当载体。
化学物质在MFs上的吸附和解吸受物理性质（表面积、状况、结晶度）、化学性质（聚合物类型、疏水性）以及化学物质本身和周围环境的性质的影响。与“原始”或未经风化的MFs相比，吸附了环境暴露（“风化”）MFs的污染物可能导致MFs具有不同的化学特征和毒性。对MF的风化程度和类型可能影响其表面形态和化学特征。
光谱分析通常用于通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱和激光直接红外（LDIR）化学成像光谱等技术检测微塑料。使用这些技术的一个复杂因素是，需要去除有机物以识别存在的任何MPs，并确保光谱识别不受干扰。这需要对样品进行消化，以有效去除周围的基质，而不对MPs造成物理或化学改变。过于剧烈的消化方法可能导致MPs发生改变，由于“风化”而导致不准确或不成功的光谱分析。另一方面，无效的消化过程可能会掩盖分析中的MPs，再次导致不正确的光谱读数。MFs由于其形状而具有更大的表面积，似乎更容易受到化学改变，但这种可能性尚未被研究。
使用LDIR的一个优点是它既快速又可靠。LDIR使用红外（IR）光谱仪，可以识别聚合物类型，具有快速可调量子级联激光器作为光源，以及能够确定颗粒数量、尺寸和形态的高速扫描成像系统。LDIR能够在成像前扫描样本，并仅分析有颗粒存在的区域，从而缩短分析时间。然而，一个缺点是，如果两个颗粒彼此靠近或接触，它们会被记录为一个颗粒，并且只获取一个光谱。另一个值得注意的缺点是，LDIR仪器记录的红外波段较窄，信息量较少，使其更容易错误识别风化颗粒。
1.5. 样品消化与回收率
回收程序能够更准确地估计特定基质中的微塑料，并评估所用提取方案的有效性。回收率可以通过向特定基质中添加已知数量的MPs，然后对样品进行消化方案来确定。消化方案通常使用酸性、氧化性、碱性、酶解消化或这些技术的组合进行。然后重新计数添加的颗粒以确定回收率。回收率<100%表明低估了MPs（提取过程中颗粒丢失），而回收率>100%则意味着高估了MPs（可能是由于单个颗粒破碎成多个碎片，每个都被计数）。
回收程序还可用于评估提取技术可能对添加的MPs造成的任何改变。MP研究使用各种提取技术，其中少数进行了回收程序以评估其结果的准确性。绝大多数MP研究缺乏回收率研究。在少数记录了回收率的研究中，大多数使用MP颗粒，尽管MFs在我们的日常生活中非常普遍。这些研究也强调了所用提取方法可能导致MPs被低估。高估的报告较少见，可能是由于主要使用MP颗粒而非更易破碎的MFs。MP研究中，特别是涉及纤维的回收率程序非常缺乏。
1.6. 微塑料理解中未解决的问题
尽管MFs在日常生活中普遍存在且具有毒性，但与颗粒相比，它们的研究明显不足，颗粒在MPs研究中获得了大部分关注。因此，目前仍不确定MFs是否表现出与颗粒相似的行为，特别是MFs在提取中是否以与颗粒相当的比率被回收，消化过程中是否发生任何化学变化，以及是否发生任何形态变化。这项研究是首次尝试解决和更好地阐明这些问题。我们旨在通过从人肺组织中提取添加的PET和PP MFs来建立基准回收率，评估消化过程后PET和PP MFs红外光谱图中潜在的光谱变化，并通过光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）探索MFs的物理特性，以记录在组织消化过程中可能发生的任何改变。这项研究的结果有助于更好地了解人体组织中MF浓度的低估或高估，使我们能够更好地评估未来潜在的健康风险。
2. 材料与方法
2.1. 微纤维制备
从蓝色PET棘轮带和橙色PP打包绳上解开或撕开，露出微塑料纤维束。每种类型首先用手术刀切割至2000 μm，然后用镊子分离出单根纤维。总共取出100根2000 μm的PET和PP纤维，放在带网格的显微镜载玻片上，在4倍放大倍数下观察并再次计数，获取图像。通过用乙醇冲洗载玻片三次，将PET和PP纤维（长度为2000 μm）添加到500 mL玻璃烧杯中，并用铝箔覆盖。在显微镜下观察载玻片以确保没有纤维残留在载玻片上。此过程也用于100根500 μm长的PET纤维和100根500 μm长的PP纤维。总共准备了六个烧杯，三个装有2000 μm PET纤维和500 μm PP纤维，三个装有500 μm PET纤维和2000 μm PP纤维。
从四个MFs组中各取几根MFs，分别放在低辐射率的Kevley载玻片上。使用基于量子级联激光器的Agilent 8700 LDIR化学成像系统和clarity软件（版本1.6.83）分析样品，并获得四个不同MFs组的光谱。
此外，从四个MFs组中各取几根MFs，分别放在各自的显微镜载玻片上，在4倍放大倍数下观察，获取图像以评估物理特性。然后，准备MFs用于扫描电子显微镜（SEM）成像；从四个组中各取代表性的MFs，安装并用金溅射镀膜以使聚合物导电。拍摄图像以评估物理特性。
在准备四个MFs组的整个过程中，保持了清洁、无塑料的环境，并且只使用非塑料工具。所有设备在使用前后都用乙醇清洗三次，并穿着100%白色棉质实验服。
选择2000 μm和500 μm的纤维尺寸指标是基于Jenner等人的发现，他们从人肺组织样本中发现MFs长度可达2475 μm，平均为248 μm，以及Chen等人的发现，他们发现在病变和正常肺组织中纤维的平均长度分别为1490 μm和1750 μm。
2.2. 消化前微纤维的物理形态
PET MFs通过拆解棘轮带并切割纤维至所需长度制成；因此在制备过程中处理极少。消化前，这些纤维，无论是2000 μm还是500 μm，都呈现出光滑的圆柱形纤维形状。在整个长度上没有检测到表面凹槽或裂纹，但一些2000 μm的MFs中间部分有轻微的压扁。末端因切割时手术刀的下压力而显得扁平。PP MFs是通过展开打包绳的一部分，露出扁平纤维聚集在一起的片状材料制成。用镊子撕开和分离片材成单根纤维，然后切割至所需的2000 μm和500 μm长度。由于手动制备单个PP MFs，处理更多，MFs呈现出粗糙或“风化”的外观。在2000 μm和500 μm的MFs上，整个表面有许多凹槽，纤维周围有碎片。还有沿长度方向纵向延伸的裂纹，这些地方可能更容易分裂。
2.3. 肺组织添加
按照Coffman-Rea等人建立的方案，从福尔马林灌注的人体尸体标本上取下左下叶，并使用手术刀精细切碎组织，制备六个样本（每个3 g）。每个样本放入六个含有纤维的烧杯之一中，并搅拌以使纤维与组织混合。
2.4. 肺组织消化和微纤维提取
以下方法改编自Coffman-Rea (2024)。向每个烧杯中加入总计50 mL的TRIS缓冲溶液（0.2 M）（pH 8.2）和300 μL [≥20,000 U/g]的米曲霉脂肪酶。将烧杯放入水浴中，设置为50 °C和65 rpm。24小时后，再加入300 μL脂肪酶。在脂肪酶中处理48小时后，向每个烧杯中加入10 mL 5%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液（最终SDS浓度为0.8%）和500 μL [≥2.4 U/g]的芽孢杆菌蛋白酶，并在50 °C和65 rpm下孵育。24小时和48小时后分别再加入500 μL蛋白酶。酶处理后，向每个烧杯中加入80 mL 30%过氧化氢以消化残留的有机物。将烧杯放入50 °C水浴中，并监测以确保H2O2引起的反应不会导致溶液溢出。当氧化产生的泡沫达到烧杯顶部时，将烧杯从加热处移开，并使用3-5 mL乙醇减少气泡；在室温下冷却一小时后，将烧杯放回水浴中。一旦反应减弱且不存在颗粒丢失风险，将烧杯在50 °C水浴中放置4天。在整个过程中烧杯用铝箔覆盖。然后，六个样品分别真空过滤到各自的聚碳酸酯镀金（PCTG）膜（0.8 μm孔径）过滤器上。
2.5. 回收计数
使用激光直接红外（LDIR）化学成像光谱分析六个PCTG膜过滤器，获取每个过滤器的图像并创建相应的数据表。然后对每个过滤器进行超声处理并转移到带网格的显微镜载玻片上，在光学显微镜下观察计数。获取每个过滤器回收的所有PET和PP MFs的图像。也获取了畸形MFs的图像，并且MFs计数三次以确保结果准确。
确定回收率后，将四种类型（2000 μm和500 μm的PET，以及2000 μm和500 μm的PP）的纤维各取一些放在低辐射率的Kevley载玻片上，用LDIR和clarity软件（版本1.6.83）分析，并获得消化后每种纤维的光谱。
2.6. 质量保证与控制
实施了措施以防止任何固有污染。在整个实验室过程中穿着棉质（100%）实验服。未使用塑料制品。工具和玻璃器皿用过滤乙醇和水彻底冲洗。样品始终用铝箔覆盖，仅在添加试剂时取下，并在样品处理的每一步后立即重新覆盖。为减少样品处理过程中微纤维损失的风险，有意避免使用通风橱或其他通风系统。虽然在专注于微塑料检测的研究中使用过程空白来考虑空气污染是标准做法，但本实验未使用空白，因为我们的目标是回收具有特定长度、颜色和聚合物类型的添加微纤维。尽管文献中回收率研究有限，但现有的专注于回收率的研究并未描述使用过程空白。
2.7. 统计分析
使用IBM SPSS Statistics 31.0进行显著性统计检验，在p值≤0.05时认为具有显著性。
3. 结果与讨论
3.1. 回收率
LDIR的一个局限性是，具有相似光谱的重叠或接触的MPs可以合并为一个检测，从而降低了准确定量的能力。本研究中使用的纤维切割成相同长度，并来自相同的宏观塑料来源，因此它们之间几乎没有或没有区别性的变化。此外，在最终过滤步骤后，许多添加的纤维在过滤器表面缠绕在一起或盘绕；同时，许多与残留的有机物交织在一起。这些条件导致LDIR成像系统将多根纤维解释为单根纤维。尽管图像分析的最新进展，包括分水岭算法和机器学习以改进分割，显示出改善聚集微塑料区分度的前景，但我们样品中纤维和残留有机物的高负载需要手动计数，以避免回收被严重低估。未来使用LDIR的回收率研究应考虑减少初始纤维数量、使用更小的样品或将样品分散在多个过滤器上，以改善纤维在过滤器上的分散。这些调整可以使自动成像系统更准确地量化纤维。
PCTG过滤器上MFs的数量和表面积很大，由于重叠，导致LDIR的计数和测量结果有偏差。在所有六个样品中，从LDIR获取的数据报告了检测到的PET和PP数量；然而，只有一小部分计数与添加的MFs的尺寸测量结果匹配。通过对PCTG过滤器的目视检查，很明显存在比LDIR记录的更多的添加MFs，这是由于纤维重叠，导致对MFs的严重低估。与视觉识别和手动计数相比，LDIR显著地少计数了微纤维。在所有样品中，与手动检测的纤维相比，尺寸参数匹配并被LDIR“计数”的MFs比例在0%到27%之间，这意味着LDIR少计数了73%到100%。Mann-Whitney U检验显示，PP纤维的LDIR检测计数显著高于PET纤维，这很可能是由于消化导致的PP纤维撕裂造成的。
为了解决这个问题，对每个过滤器进行超声处理，并将内容物转移到单独的网格显微镜载玻片上，使用光学显微镜手动计数MFs。MFs被分类为“正常”或“畸形”。“正常”MF在整个提取过程中保持颜色、尺寸和形状一致，而“畸形”MF则表现出尺寸减小或颜色变化。获取每个MF的图像，并且MFs计数了三次。回收率使用正常MFs计算，同时也考虑了正常和畸形MFs。
3.2. 消化后微纤维的物理形态
大部分回收的PET MFs相对未受消化过程影响，保持光滑的圆柱形外观。一些2000 μm纤维的中段有少量可见的表面裂纹和碎片，没有回收到的PET MFs显示有断裂或撕裂。一些PET MFs的末端仍然扁平，与消化前一样。两种长度的少数PET MFs中间部分变薄，少数500 μm的PET MFs末端附近有扁平部分。在回收的PP MFs中，两种长度都显示出开始撕裂和分离的迹象，并且回收的MFs群体中存在许多更薄的新PP MFs来体现这一点。与消化前的MFs相比，MFs的外表面显得稍微更风化。
3.3. PET和PP微纤维回收率的比较
MPs可以通过多种方式进行量化。两种常见方法是每单位（例如，克、升）样品中的颗粒或纤维数量，或其相对于样品质量或体积的总质量。本研究侧重于每克组织中的颗粒数量，因为此指标与MP回收率研究计算回收率效率的方式一致。
初始2000 μm PET MFs总数为300，回收137根（45.67%）。初始500 μm PP MFs总数为300，回收280根（93.33%）。初始500 μm PET MFs总数为300，回收145根（48.33%）。初始2000 μm PP MFs总数为300，回收274根（91.33%）。500 μm PET MFs的回收率比2000 μm PET MF高2.66%。500 μm PP MFs的回收率比2000 μm PP MF高2%。比较样品一、二和三中2000 μm PET和500 μm PP的回收率，500 μm PP的平均值和标准差更大。比较样品四、五和六中500 μm PET和2000 μm PP的回收率，2000 μm PP的平均值和标准差更大。
PET的总回收率为47%，PP的总回收率为87%。PP的较高回收率被认为是由于在许多消化后PP MFs的形态中观察到的开裂和撕裂。这种撕裂可能导致比最初添加更多的纤维，从而扭曲回收率并导致高估。PP MFs的直径大于PET MFs，并且许多消化后的PP MFs具有纵向裂纹，这可能导致了观察到的撕裂。少数进行了MP回收率的研究表明，通常存在对MPs的低估。这对于PET MFs成立，但PP MFs表现出高估。我们想要记录组织消化引起的任何物理变化。尽管MPs的消化诱导变化已被记录，但在考虑文献中更常报告MPs被低估时，PP样品中观察到的破碎程度是出乎意料的。
由于本研究通过颗粒数量而非质量来量化微塑料，我们没有测量消化前PP纤维的初始质量。我们建议未来的工作结合质量与纤维计数的配对回收评估，以更好地了解消化可能在多大程度上增加PP的回收计数。
Wilcoxon符号秩检验显示，PP MFs的回收率显著高于PET。相反，2000 μm和500 μm纤维之间的回收率没有显著差异。这些结果表明聚合物类型可以影响回收率，而尺寸则不能。然而，结果可能并不完全反映真实的回收效率，因为我们记录了PP MFs比PET表现出更大的物理变化和脱落。有可能是脱落人为地增加了PP回收率，产生了额外的纤维，从而导致了观察到的聚合物类型之间的统计学显著差异。
3.4. 畸形微纤维
一些回收的MFs呈现畸形（尺寸、形状或颜色改变）。在回收的总PET MFs中，不到1%被归类为畸形。在回收的总PP MFs中，13.83%被归类为畸形。一个可能的原因是，使用的PP MFs薄而扁平，更容易撕裂或进一步分离，而使用的PET MFs是圆柱形纤维，更容易断裂而非撕裂。许多记录的畸形PP MFs体现了这种“撕裂”。
已知PP容易因氧化而脆化和碎裂增加。也有文献记载PET也会因风化和消化技术而发生改变，但其结构上比PP更耐降解。然而，专注于消化技术的研究报告称，在受控条件下（例如，浓度、时间、温度），氧化消化对PET和PP物理和化学性质的影响很小。
本研究所选的消化方案使用了温和的氧化条件（即<30% H2O2，50 °C，4天），因此我们没有预期PP MFs会发生显著的降解或脆化。此外，该方案先前已用于聚苯乙烯微珠回收研究，在该研究中未观察到H2O2处理后PS微珠的物理变化。我们的结果和PP的意外高回收率表明，即使在受控条件下，PP可能比先前记录的更容易受到氧化消化的影响。
另一个考虑因素是，本研究中的MFs来源于未经自然环境风化（例如，紫外线暴露、热循环、机械力）暴露的原始塑料。众所周知，这些环境因素导致宏观塑料破碎成微塑料。此外，据报道，人工风化的PP和PET表现出结构弱化，使其更容易受到消化相关损伤的影响。
我们认为，未来的工作直接比较原始和环境风化的PP纤维在温和氧化消化条件下的情况，将有助于更好地理解先前的氧化损伤如何影响回收效率。此类研究将有助于阐明消化引起的破碎是否有助于现实世界微塑料分析中PP的高估。
3.5. 颗粒损失
本研究中颗粒损失的一个主要因素可能与MFs粘附在设备上有关。与样品的交互被最小化到提取技术所需的步骤，所有设备和工具都经过三次冲洗以帮助去除任何颗粒物质，但可能并非所有MFs都被去除。颗粒损失的另一个潜在原因可能是MFs切割和计数后从载玻片转移到烧杯的初始过程。虽然载玻片和烧杯之间的距离很短，但由于其物理和化学特性，MFs极易变得飞扬，并可能在短时间内在被冲入样品烧杯前离开载玻片。
3.6. 光谱变化
比较消化前和消化后的光谱，两种长度（2000 μm和500 μm）的PET MFs都有轻微的光谱变化。2000 μm PET的初始光谱在约1750、1250和1100 cm-1处有峰。2000 μm PET的消化后光谱在约1750 cm-1处有一个主峰。500 μm PET的初始光谱在约1800 cm-1处有一个大峰，并在1600至1400 cm-1之间有一系列较小的峰。500 μm PET的消化后光谱在约1800 cm-1处仍有一个大峰，在1600至1400 cm-1之间有一系列较小的峰，但在约1250和1100 cm-1处也有峰。然而，聚合物识别没有改变，LDIR两次都将MFs识别为PET。
2000 μm和500 μm PP MFs记录的光谱保持相对不变，观察到很少变化。消化前和消化后的2000 μm和500 μm光谱在约1400 cm-1处显示两个峰。PP MFs的聚合物识别也没有改变，LDIR两次都将MFs识别为PP。
与使用其他光谱方法（例如，FTIR，拉曼）相比，使用LDIR的一个限制是它只检测有限的光谱范围，通常称为“指纹区”。虽然这个区域足以准确识别大多数聚合物，但它排除了官能团或诊断区，该区域发生特征伸缩振动并提供有关化学风
