《International Journal of Molecular Sciences》：Precise CRISPR-Mediated Editing of the TGFBI R555W Mutation in Patient-Derived Peripheral Blood Mononuclear Cells
Burak Dagdelen,
Hilal Arikoglu,
Dudu Erkoc-Kaya and
Banu Bozkurt
编辑推荐：
本研究在携带颗粒状角膜营养不良1型（GCD1）致病突变R555W的TGFBI基因患者来源的外周血单个核细胞（PBMC）中，通过设计和递送sgRNA与单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板，成功实现了CRISPR/Cas9系统介导的同源定向修复（HDR），验证了在患者原代细胞中进行精确基因编辑的技术可行性，为后续针对角膜疾病的体内基因治疗研究提供了初步的技术平台和方法学框架。
引言
角膜营养不良是一组遗传性、非炎症性疾病，以进行性角膜透明度丧失和视力损害为特征，影响约0.09%的人口。其中，转化生长因子β诱导蛋白（TGFBIp）的编码基因TGFBI发生突变是多种角膜营养不良的病因。目前已发现超过70种TGFBI基因突变，其中R555W（c.1663C>T）热点突变是导致1型颗粒状角膜营养不良（GCD1）的主要原因。GCD1的特征是角膜各层出现圆形、不规则、灰白色的沉积物，导致视力模糊、畏光和进行性视力下降。当前针对角膜上皮的临床方法（如角膜切除术和角膜移植）不足以延缓、阻止或消除沉积物的形成。因此，旨在提供长期或永久解决方案的基因治疗策略，特别是基因编辑技术，受到了越来越多的关注。在可编程核酸酶中，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统因其简单、通用和高效率，已成为最广泛应用的强大基因组编辑平台。该系统中，Cas9在单向导RNA（sgRNA）的引导下，作为内切酶在特定基因组位点引入DNA双链断裂（DSBs）。这些DSBs可以利用单链寡脱氧核苷酸（ssODN）作为供体模板，通过同源定向修复（HDR）进行修复，从而实现精确的基因组编辑。尽管之前的研究已在实验系统中证明了CRISPR/Cas9介导的靶向TGFBI突变的可行性，但递送效率、细胞类型特异性和长期疗效等问题仍然是临床转化的重大障碍。外周血单个核细胞（PBMC）作为一种可获取的原代细胞，为在患者来源的细胞中评估基因组编辑策略的技术性能提供了一个实用的平台。
结果
2.1. 从GCD1患者中分离和原代培养PBMC
从一名携带TGFBI基因第12外显子杂合R555W（c.1663C>T）突变的GCD1患者体内分离出PBMC。分离后，PBMC用植物血凝素（PHA）刺激72小时，随后在标准培养条件下扩增，直至进行CRISPR/Cas9介导的基因编辑实验。在转染前阶段，细胞培养保持了高细胞活力和正常的形态。
2.2. sgRNA连接到pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA质粒
本研究设计了三条靶向TGFBI R555W突变的单向导RNA（sgRNA）及其对应的单链寡脱氧核苷酸（ssODN）供体模板。其中，sgRNA1和sgRNA2靶向正义链，而sgRNA3靶向TGFBI基因的反义链。T nucleotide and the R555W mutation site are highlighted in dark and light blue, respectively.">所有sgRNA均成功克隆到pCAG-eCas9-GFP-U6-gRNA质粒的支架区域。克隆流程包括BbsI酶切、sgRNA连接、细菌转化、抗生素筛选和Sanger测序验证。
2.3. PBMC的电穿孔
培养三天后，收集PBMC并重悬于电穿孔缓冲液中。每次反应，将1 x 106个细胞与2 μg的sgRNA克隆质粒DNA和1 μg的相应ssODN供体模板混合，然后使用单次方波脉冲（250 V, 5 ms）进行电穿孔。质粒递送通过电穿孔后24小时通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）表达得到确认。随后通过荧光激活细胞分选（FACS）对GFP阳性细胞进行分选。sgRNA1-ssODN1、sgRNA2-ssODN2和sgRNA3-ssODN3组的转染效率分别为3.7%、2.7%和2.4%。分选后的PBMC在标准条件下培养，用于下游基因组编辑分析。
2.4. 基因组编辑分析
高分辨率熔解曲线（HRM）分析用于对分选PBMC的DNA扩增产物进行初步筛选，以识别基因组编辑事件。未经CRISPR处理的PBMC的DNA显示出异源双链熔解曲线，而经过CRISPR处理的样本显示出同源双链熔解曲线，表明在目标位点发生了序列修饰。在测试的sgRNA-ssODN组合中，与模拟处理细胞及其他sgRNA-ssODN组相比，sgRNA3-ssODN3组显示出明显可区分的熔解曲线谱，这表明在目标位点成功发生了编辑。基于其独特的HRM谱，选择sgRNA3-ssODN3组合进行后续的下一代测序（NGS）分析，以精确量化编辑结果。
下一代测序（NGS）分析证实了在TGFBI基因中存在CRISPR/Cas9介导的c.1663C>T（R555W）突变编辑，这与HRM筛选结果一致。对分选的GFP阳性PBMC的分析表明，预定的T>C替换是主要的编辑结果，占测序读数的98.2%，而未编辑的突变等位基因和小缺失事件的频率分别为1.2%和0.6%。
讨论
本研究评估了在来自GCD1患者的外周血单个核细胞（PBMC）中，通过CRISPR/Cas9介导编辑TGFBI基因R555W热点突变的技术可行性。需要强调的是，这项工作并非旨在竞争或替代在角膜细胞类型中进行的研究，而是通过建立一个技术稳健、源自患者细胞的平台来评估对临床相关TGFBI突变的精确编辑，从而补充现有文献。
虽然PBMC并非GCD1中受影响的主要疾病相关角膜上皮细胞，但它们为快速优化和验证CRISPR/Cas9基因组编辑策略提供了一个可及的患者来源的体外平台。使用PBMC可以在过渡到生物学上更相关的角膜细胞模型之前，在患者自身的遗传背景下评估编辑效率、供体设计和工作流程可行性。此外，技术验证通常需要多轮优化，而外周血采集因其微创性，最大限度地减轻了患者负担，并避免了更侵入性的组织取样程序。因此，本研究的主要目的是精确HDR介导的编辑的技术验证，而非直接的治疗建模。这种逐步方法可能有助于后续向角膜上皮或基于干细胞系统的转化。
TGFBIp第555位的精氨酸（R）被色氨酸（W）取代是导致GCD1中角膜基质层沉积物形成的原因。目前针对角膜上皮细胞的临床治疗方法旨在清除沉积物，但由于角膜上皮细胞会从位于角膜缘的干细胞不断补充，这些改善通常是暂时的。因此，旨在解决GCD1潜在遗传缺陷的基因治疗方法，包括基因替换、基因沉默和基因组编辑，越来越受到科学界的关注。特别是CRISPR/Cas9介导的基因组编辑，它可以在诱导靶DNA序列双链断裂（DSBs）后，利用外源供体DNA模板通过同源定向修复（HDR）实现精确编辑。在针对TGFBI相关角膜营养不良的研究中，已证明通过CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接（NHEJ）选择性沉默突变等位基因而不影响野生型等位基因，可以减轻疾病表型。
在sgRNA设计中，我们设计了三种不同的sgRNA：sgRNA1和sgRNA2靶向DNA的正义链，sgRNA3靶向反义链。sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3分别设计在距离R555W突变位点64、68和6个核苷酸处诱导DSBs。sgRNA3的切割位点距离目标突变最近，这被认为是其编辑效率最高的关键因素之一。为了增强HDR效率，我们设计了三个200个核苷酸长的ssODN作为修复模板。每个ssODN在其第1663位核苷酸处含有一个胸腺嘧啶（T），用于纠正TGFBI基因第12外显子中的R555W突变，并引入了沉默突变以防止编辑后sgRNA的重新结合。
在本研究中，我们使用了PBMC，因为它可以通过外周血非侵入性获取，且比许多其他原代细胞类型更容易培养。然而，由于PBMC固有的低转染能力，将CRISPR/Cas9组分有效递送到PBMC中仍然具有挑战性。我们采用电穿孔法以提高转染效率。本研究中PBMC的分选效率高于之前Johnston等人使用相同质粒在淋巴细胞中进行的CRISPR/Cas9研究。
本研究的HRM分析采用了优化的引物设计，扩增子长度为143 bp，GC含量为48%，这在可靠的HRM性能最佳范围内。与这些设计考量一致，HRM分析显示，用sgRNA3-ssODN3引导的CRISPR/Cas9系统转染的PBMC具有明显可区分的熔解曲线谱，这与靶位点的序列修饰一致。我们分析，这一结果源于sgRNA3诱导的DSB比其他sgRNA更接近目标R555W突变位点。事实上，sgRNA3诱导的DSB距离突变仅6个核苷酸，而sgRNA1和sgRNA2产生的DSB分别距离64和68个核苷酸。因此，sgRNA3引导的Cas9编辑最为有效。这与先前报道一致，即基因组编辑效率随着CRISPR/Cas9诱导的DSB靠近靶位点而增加。
根据ssODN3/CRISPR编辑的PBMC的下一代测序（NGS）结果，HDR效率非常高。我们认为有几个因素可以解释这一结果。首先，高HDR比率最可能的原因是使用分选的PBMC评估基因组编辑效率，这富集了成功转染的细胞群体。其次，我们使用了双链切割核酸酶Cas9，而非切口酶。最后，我们研究中使用的ssODN含有沉默的阻断突变，这可以防止ssODN与sgRNA杂交，从而保护它们免受Cas9介导的切割，保留更大比例的ssODN用于HDR。这些阻断突变还通过防止sgRNA的重新识别和重新切割来保护编辑后的基因组区域。
角膜因其无血管、免疫豁免、易于获取，并且与成熟的手术和先进成像技术兼容，是体内和体外基因治疗研究的理想靶点。基于CRISPR的临床基因治疗方法仍需大量研究来修复导致眼部各层疾病的突变。然而，在应用于临床之前，基因疗法必须广泛研究以消除脱靶活性和可能的细胞毒性效应。尽管CRISPR/Cas系统的开发和应用进展迅速，但也强调需要适当的监管以确保负责任的临床转化。
尽管本研究具有优势，但也存在几个局限性。首先，基因组编辑实验是在PBMC中进行的，它并不代表疾病相关的角膜细胞类型，也不能重现角膜特异性的TGFBI表达或病理。因此，本研究设计为一项技术可行性研究，而非疾病模型或治疗研究。其次，编辑效率是在GFP阳性、分选的PBMC中评估的，这导致了高度富集的细胞群体；因此，报告的HDR效率并不反映整体的编辑效率或等位基因特异性结果。第三，没有进行脱靶活性和等位基因特异性编辑的实验验证，脱靶评估仅限于计算机预测。最后，本研究未包含额外的对照实验，如野生型供体细胞或非靶向构建体，其设计是一项技术概念验证。在解释结果时，应考虑这些局限性，并强调未来需要在疾病相关的角膜细胞模型中进行包含全面安全性评估的研究。
本研究的主要目标是建立一种可应用于疾病相关角膜上皮或基于干细胞模型的技术优化的CRISPR/Cas9工作流程。我们未来的研究将侧重于将此策略转移到角膜细胞类型，评估TGFBI表达的功能恢复，并进行全面的安全性评估，包括脱靶和表型分析，以支持潜在的转化应用。
