《Toxins》：Simultaneous Determination of Multiclass Cyanotoxins in Aquatic Products, Vegetables and Algal Dietary Supplements Using Dispersive Solid-Phase Extraction (dSPE)-UHPLC-MS/MS
Baiyu Lai,
Guanxiang Yuan,
Qing Luo,
Xiaoyun Qin,
Zhaoying Lv,
Haojia Ma,
Huiling Chen,
Honghe Liu,
Guihua Liu and
Jie Jiang
编辑推荐：
本研究开发了一种基于分散固相萃取(dSPE)与超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)联用的方法，用于同时测定水产品、蔬菜及藻类膳食补充剂中四类常见蓝藻毒素（微囊藻毒素MCs、柱孢藻毒素CYN、节球藻毒素NOD和拟柱孢藻毒素ANA-a）。该方法经在八种食品基质中验证，显示出良好的回收率(65–122%)、高灵敏度（检出限LODs为0.1–3.4 μg/kg dw）与高精密度，成功应用于真实样品检测，为食品中多类蓝藻毒素的高通量监测提供了快速、经济、有效的分析工具。
蓝藻毒素的食品污染风险与高通量检测新方法
引言
由人类活动与气候变化驱动的水体富营养化已成为全球水生生态系统的严重威胁，近40%的淡水湖泊受到影响。蓝藻毒素是蓝藻的次级代谢产物，在富营养化水体中普遍存在，并通过受污染的水和食品对人类健康构成重大风险。全球淡水湖中主要的蓝藻毒素包括微囊藻毒素(MCs, 63%)、柱孢藻毒素(CYNs, 10%)、拟柱孢藻毒素-a(ANA-a, 9%)和节球藻毒素(NOD, 2%)。由于其普遍存在、环境持久性及多种不良健康效应（如肝毒性、免疫毒性、神经毒性），多种蓝藻毒素已受到监管。虽然饮用水是人类接触蓝藻毒素的主要来源，但食品污染等其他途径也值得关注。多种食品，如水生动物、受污染水灌溉的作物和蔬菜，以及与非产毒藻类共存的藻类膳食补充剂，均可从受污染水中累积蓝藻毒素。因此，监测食品中的蓝藻毒素至关重要。然而，目前针对食品中多种蓝藻毒素类别同时检测的分析方法仍然有限，多数研究仅聚焦于MCs。
在各种检测技术中，超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)因其高选择性、灵敏度与高通量而被广泛应用。由于食品样品中存在大量干扰物，样品提取后通常需要进一步净化。现有净化方法如直接稀释、固相萃取(SPE)等，或适用范围有限，或过程复杂、昂贵、耗时。分散固相萃取(dSPE)技术相比之下更具成本效益、快速且操作简单，但现有dSPE方法通常仅针对单一食品基质或单一类别蓝藻毒素。因此，本研究旨在开发并验证一种基于dSPE结合UHPLC-MS/MS的方法，用于同时测定水产品、蔬菜和藻类膳食补充剂中四类常见蓝藻毒素，为食品监测计划中多种蓝藻毒素的快速定量提供技术支持。
仪器条件优化
尽管所有目标蓝藻毒素的质谱参数（如母离子和子离子）已有报道，但鉴于不同研究间报道的多反应监测(MRM)参数差异较大，特别是对于MCs，仍需建立本地优化参数。本研究分别在AB SCIEX QTRAP?6500+和Shimadzu 8060NX两台仪器上建立并优化了目标蓝藻毒素的MRM通道。结果显示，ANA-a和CYN的MRM通道在两台仪器间保持一致，也与先前研究一致。NOD在两台仪器上产生相似的母离子和子离子，但定量离子的选择基于各自仪器上的相对丰度。对于MC-LA和MC-LF，尽管母离子一致，但其二次裂解模式在AB 6500+和Shimadzu 8060NX之间存在显著差异，导致子离子不同。对于其他MC变体，母离子在正离子模式下可能表现为单电荷[M + H]+加合物或双电荷[M + 2H]2+加合物，但这些加合物的相对丰度在两台仪器间存在差异。结果表明，除相同或类似仪器类型外，所有已报道的蓝藻毒素MRM通道仅能作为参考。在液相色谱条件方面，虽然正相色谱柱能改善两种亲水性蓝藻毒素ANA-a和CYN的保留，但未能为MC变体和NOD提供足够的色谱分离。因此，最终选择了15 cm C18柱用于分离14种目标蓝藻毒素，通常采用5%的初始流动相有机相比例，因为更高的比例会导致ANA-a和CYN产生显著的溶剂效应，引起峰形异常和峰分裂。
提取条件优化
以螺旋藻膳食补充品和鲫鱼分别作为植物基和动物基食品基质的代表，对蓝藻毒素的样品前处理条件进行优化。比较了不同比例（10%、20%、40%、60%、80%和90%）的甲醇-水混合物作为提取溶剂。结果显示，对于MCs和NOD，80%甲醇-水溶液的提取效率最高，这与大多数关于蔬菜和藻类膳食补充剂的研究报道一致。对于ANA-a和CYN，在鲫鱼和螺旋藻样品中，其在40-60%甲醇-水中的提取效率最高，超过60%后呈下降趋势，这可能归因于其相较于MCs和NOD更强的亲水性。因此，最终选择80%甲醇-水溶液作为最佳提取溶剂。在5-15分钟区间内，超声时间对目标蓝藻毒素的提取效率影响有限。关于提取次数，ANA-a对提取次数最不敏感，单次提取即可获得良好回收率。然而，CYN、NOD、MC-LF、MC-LR、[D-Asp3]MC-LR和MC-LW需要至少两次提取才能显著提高回收率。MC-HtyR和MC-YR每次提取均有大量毒素回收，因此需要三次循环。而对于MC-LY、MC-HilR、MC-WR和MC-LA，在鲫鱼和螺旋藻中分别经过2-3次提取循环后达到最佳提取效率。综合考虑上述结果，一般建议进行三次提取。
净化条件优化
与传统的SPE方法相比，dSPE技术通过将固体吸附剂分散到样品基质中以最大化吸附剂与目标化合物的接触面积，从而实现改进的样品净化。因此，dSPE过程的效率主要依赖于合适吸附材料的选择及其最佳用量。对于吸水剂，比较了两种最常见的干燥剂无水硫酸镁(MgSO4)和无水硫酸钠(Na2SO4)的脱水效率及对目标蓝藻毒素的潜在吸附。结果显示，MgSO4的脱水能力显著高于Na2SO4，150 mg MgSO4与400 mg Na2SO4的干燥效果相当。然而，此用量的MgSO4也会意外吸附部分甲醇，导致除脱水外的额外体积损失。在毒素吸附方面，150 mg MgSO4对多种蓝藻毒素的吸附显著高于400 mg Na2SO4。因此，最终选择400 mg无水硫酸钠，因其具有足够的脱水能力且对目标蓝藻毒素的吸附影响有限。
为确定dSPE的最佳吸附剂，评估了四种常用材料：50 mg C18、50 mg PSA、15 mg GCB和50 mg中性氧化铝。这些吸附剂具有不同的杂质去除特性：C18适用于非极性杂质（如脂肪），PSA针对极性杂质和含羧基化合物，GCB适用于色素，中性氧化铝用于温和脱脂。理想的吸附剂应选择性吸附提取物中的主要杂质，同时不吸附目标蓝藻毒素。首先研究了这些材料对14种蓝藻毒素的吸附情况。结果显示，PSA对大多数蓝藻毒素有显著吸附，中性氧化铝也对某些蓝藻毒素表现出吸附。同时，C18对几乎所有目标蓝藻毒素的回收率最高，其次为GCB。因此，选择C18作为候选吸附剂。为评估其杂质去除能力并确定最佳吸附剂用量，使用不同用量C18吸附剂应用于螺旋藻膳食补充剂和鲫鱼提取物进行对比实验。仅在吸附剂量达到50 mg及以上时，两种样品基质才实现基质澄清。大多数目标蓝藻毒素在50 mg吸附剂剂量下回收率最高。因此，选择50 mg C18吸附剂作为最佳用量。此外，在螺旋藻膳食补充剂样品中观察到明显的色素干扰，表现为浓缩样品不清澈。为解决此问题，在上述dSPE材料中为植物基食品基质额外加入了15 mg GCB，且未显著损害其高回收率。总体而言，使用400 mg无水硫酸钠和50 mg C18的净化方案对水产品中的14种蓝藻毒素表现出最佳性能。对于藻类膳食补充剂，则需要额外加入15 mg GCB。
方法验证结果
在多种代表性食品基质上对所建立的方法进行了验证，包括鲫鱼、罗非鱼、菲律宾蛤仔、大黄鱼、生菜、黄瓜、螺旋藻膳食补充剂和小球藻膳食补充剂。评估了基质效应(MEs)、线性、准确度、精密度和灵敏度。结果显示，大多数目标蓝藻毒素表现出显著的基质抑制效应，ME值在-81%至-21%之间。相比之下，NOD表现出明显的基质增强效应。对于MC-LA、MC-LF、MC-LR和MC-RR，在大多数研究的基质中观察到可接受的基质效应，但在某些特定基质中仍然显著。这些结果表明，尽管dSPE吸附剂可以减少来自不同食品基质的蓝藻毒素的多种干扰，但基质效应无法完全消除。这与许多先前针对农药和兽药残留的dSPE方法一致，通常采用基质匹配标准曲线。因此，为消除基质干扰并实现精确定量，为每种目标蓝藻毒素建立了八条基质匹配标准曲线。所有14种蓝藻毒素的校准曲线在其线性范围内均表现出良好的线性，R2值大于0.99。基于这些校准曲线，14种蓝藻毒素的回收率在水产品中为70-115%，蔬菜中为65-122%，藻类膳食补充剂中为70-120%。所有食品类型中各加标水平下所有蓝藻毒素的相对标准偏差均低于19%。该方法在所有八种研究的食品基质中的检出限和定量限范围分别为0.1至3.4 μg/kg干重和0.4至11.4 μg/kg干重。所开发方法的性能参数与先前报道的相当，灵敏度相较于许多其他方法有显著提高。与Leticia D.Q.等人的方法相比，观察到更高的检出限，可能归因于其有限的蓝藻毒素类别和食品基质类型。此外，该方法快速、操作简单，适用于食品样品中四种常见蓝藻毒素的高通量监测。需要指出的是，与大多数先前方法一致，本方法测定的食品中的蓝藻毒素是其游离形式。
实际食品样品的应用
经验证的方法随后应用于96个食品样品的调查，包括89个商业样品和7个野外样品。在八个食品类别中，仅两种螺旋藻膳食补充剂和四份罗非鱼样品中检出某些蓝藻毒素。对于罗非鱼，所有来自湖泊的三个样品均显示受到多种蓝藻毒素的显著污染。CYN是主要毒素，含量为9.0–14.5 μg/kg干重，其次是MC-LY、[D-Asp3]MC-LR、MC-LR和MC-LW。这与相应湖水的典型蓝藻毒素特征高度一致。尽管调查中MCs的水平远低于富营养化水体中的水平，但CYN浓度高于Berry的研究。与湖泊捕获的标本相比，仅一份市场采集的罗非鱼样品含有有限的MC-LR。这可能归因于水产养殖期间严格的环境控制。此外，湖泊捕获的鲫鱼中未检出蓝藻毒素，可能是由于不同鱼类物种的毒素累积能力不同。对于螺旋藻膳食补充剂，在两个独立样品中分别检出CYN和MC-LR。该检出率和水平与大多数先前对螺旋藻膳食补充剂的调查相当。值得注意的是，大多数藻类膳食补充剂的阳性发现与基于Aphanizomenon的产品相关，这些产品中MCs和ANA-a的检测水平较高。然而，Aphanizomenon基产品在中国市场很少见，螺旋藻是主要的藻类膳食补充剂。在本研究中，所调查的蔬菜中均未检出14种蓝藻毒素。一种可能的解释是黄瓜和生菜通常被归类为蓝藻毒素生物累积能力低至中等的蔬菜。第二个合理的因素是市场采购的蔬菜可能未使用受污染的水灌溉。
结论
本研究开发并验证了一种基于dSPE技术结合UHPLC-MS/MS的快速、简单、高通量、灵敏且经济有效的方法，用于同时测定水产品、蔬菜和藻类膳食补充剂中的四类蓝藻毒素。该方法性能与先前的SPE基方法相当或更优，并具有更广泛的食品基质适用性和蓝藻毒素覆盖范围的额外优势。该方法成功应用于96个真实食品样品，在淡水鱼和藻类膳食补充剂样品中检出了多种蓝藻毒素。因此，该方法被提议作为未来监测各种食品中多种蓝藻毒素残留的可靠工具。
