《Agriculture》：Isolation of Cellulose-Degrading Bacteria from Cenchrus fungigraminus and Their Effects on Silage Quality
Xiaxin Huang,
Yihong Xie,
Feng Tan,
Ziting Wang,
Zhijie Zhang,
Rui Yue,
Fuke Hako,
Zhanxi Lin and
Dongmei Lin
1. 引言
随着全球畜牧业的快速发展，饲料资源紧张已成为制约行业增长的关键瓶颈。在中国，年饲料总消耗量约为1.2亿吨，但仍有超过5000万吨的供应缺口。这种供需失衡不仅对畜牧业的可持续发展构成严峻挑战，也加剧了人畜争粮的结构性矛盾。近年来，真菌状蒺藜草(Cenchrus fungigraminus)因其生长迅速、生物量高、抗逆性强及具有饲用价值等显著特性而受到广泛关注。在适宜条件下，仅培育四周的巨菌草粗蛋白含量可超过10.8%，总氨基酸含量高达8.4%。六个月株高可达5米，实现一年多次刈割，年产量可达每公顷500吨，约为全株玉米青贮的2-3倍。因此，真菌状蒺藜草在缓解草畜资源配置矛盾方面具有巨大潜力。然而，其作为饲料的实际利用面临挑战，主要包括水分含量高、木质纤维素含量高及水溶性碳水化合物(WSC)浓度低，这些因素共同影响了其作为主要粗饲料的适口性和贮存稳定性。
目前，青贮技术被认为是加工和保存反刍动物饲料的主要方法。它具有长期储存、增强营养成分和改善适口性等优点，确保了全年饲料资源的稳定高效利用。然而，自然发酵过程常常面临易腐败、产生丁酸及发酵不完全等挑战。添加主要由乳酸菌和纤维素分解菌组成的青贮添加剂，可以增强发酵稳定性并优化发酵过程。真菌状蒺藜草中WSC含量低，限制了乳酸菌的发酵效率，而纤维素分解菌可以通过降解植物木质纤维素、增加可溶性糖含量，显著提高饲料的营养价值和发酵品质，同时增强适口性。因此，尽管真菌状蒺藜草固有的营养成分限制了其有效利用，但添加合适的纤维素分解菌可以显著改善其发酵品质。然而，作为一种新型饲料作物，关于纤维素分解菌对真菌状蒺藜草青贮生产影响的数据仍不清楚。
因此，本研究旨在从真菌状蒺藜草中分离、筛选和鉴定高效纤维素分解菌，并评估其在提升真菌状蒺藜草青贮发酵品质和营养特性方面的功效。我们假设，与未处理对照组相比，筛选的纤维素分解菌株与商业酶制剂的协同应用将通过以下方式改善青贮发酵：(1) 显著降解木质纤维素生物质；(2) 增强营养保留；(3) 促进乳酸积累并伴随系统pH值降低。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
本实验所用真菌状蒺藜草样品来源于2023年至2024年的国家菌草工程技术研究中心(北纬26°08′，东经119°24′)。使用自然枯萎样品分离纤维素降解菌；新鲜植株自然风干，粉碎(过80目筛)后制备为评估底物，其纤维组成为39.30%纤维素、22.95%半纤维素和13.60%木质素。青贮材料为株高2.5-3.5米的植株，切成1-2厘米段，留茬15厘米，使用前自然风干24小时，并分析其营养成分。
所用培养基包括LB培养基、筛选培养基、苯胺蓝培养基、液体培养基、滤纸条崩解培养基和液体产酶培养基等。所有试剂购自中国上海麦克林生化科技有限公司。本研究中使用的商业菌株为Bacillus velezensis (BMZ 144940)和Trichoderma longibrachiatum (CICCM 40340)。青贮添加剂包括：半纤维素酶(酶活≥5 U mg-1)和纤维素酶(酶活>50 U mg-1，主要由葡聚糖内/外切酶和纤连蛋白酶组成)，均购自上海麦克林生化科技有限公司，以及商业青贮添加剂(南华千牧)。
2.2. 分离与纯化程序
初级筛选：取真菌状蒺藜草样品，以1:9 (w/v)比例悬浮于无菌水中，均质后以160 rpm振荡1小时进行富集培养。取富集液进行10-1-10-5梯度稀释，涂布于筛选培养基平板，37°C培养48小时。选取形态典型、界限清晰的单菌落，采用划线平板法连续纯化五次。将生长良好的纯化菌株接种至斜面培养基，培养后于-80°C保存在25% (v/v)甘油溶液中长期保存。
次级筛选：采用刚果红试验筛选菌株。菌落用1 mg mL-1刚果红染色15分钟，用1 mol L-1NaCl脱色15分钟，培养2天后观察水解圈形成。测量水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)，每个菌株三个重复。选择D/d值高的菌株进行复筛。通过划线平板法验证其遗传稳定性，以获得遗传稳定的纯培养物。同时，采用苯胺蓝脱色试验评估菌株的木质素降解潜力，根据培养基脱色程度初步判断其降解能力。
三级筛选：将初筛菌株接种至液体培养基制备种子液，36°C、160 rpm振荡培养24小时。然后以5% (v/v)接种量转接至含有滤纸条的新鲜培养基中，36°C、60 rpm振荡培养15天。以等体积无菌水作为对照，每个处理三个重复。根据滤纸条分解的速度和程度筛选有效菌株。经滤纸降解试验筛选出的菌株接种至液体培养基，在相同条件(36°C, 160 rpm)下培养24小时制备种子液。将此种子液以5% (v/v)接种量转接至液体产酶发酵培养基，在相同条件下培养2天。发酵后，将培养液在4°C、8500 rpm离心10分钟。所得上清液即为粗酶提取物，收集并在4°C储存用于纤维素酶活性测定。
CMCase测定：反应混合物由1.5 mL 1% (w/v)羧甲基纤维素钠盐(溶于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)和0.5 mL粗酶提取物组成，在50°C孵育30分钟。随后加入1.5 mL DNS试剂，沸水浴加热7分钟，然后流水冷却。用蒸馏水定容至10 mL。在540 nm波长下测量吸光度，以热灭活粗酶制备的空白为对照。根据标准葡萄糖曲线计算释放的还原糖量，并据此测定酶活性。FPase测定和β-葡萄糖苷酶测定的后续步骤与CMCase测定相同。
2.3. 鉴定
形态学观察和生化特征：进行革兰氏染色后，使用油浸显微镜观察纯化单菌落的形态特征。根据《伯杰氏系统细菌学手册》对菌株的生理生化特性进行表征。
遗传学测试：使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA。提取的DNA作为模板，使用通用细菌引物PCR扩增16S rDNA基因片段。PCR反应条件如下：95°C初始变性4分钟，随后进行30个循环：95°C变性1.5分钟，56°C退火1分钟，72°C延伸1.5分钟，最后72°C终延伸10分钟，10°C冷却5分钟。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，然后送至上海生工进行测序。获得的16S rRNA基因序列提交至NCBI数据库进行BLAST比对分析，并使用MEGA11.0软件通过ML树分析确定分离株的系统发育位置。
2.4. 纤维素降解菌株降解性能研究
为评估真菌状蒺藜草纤维的降解性能，对表现最佳的菌株JC2与两种商业菌株：Bacillus velezensis (CBV)和Trichoderma longibrachiatum (CTL)进行了比较分析。设立四个处理组：(I)空白对照(CK，用无菌水代替接种物)；(II)菌株JC2；(III)CBV；(IV)CTL。菌株JC2和CBV在LB固体培养基上活化，随后转移至LB液体培养基，37°C培养24小时制备种子液。菌株CTL先在PDA固体培养基上28°C培养5天，然后转移至PDA液体培养基再培养5天。所有种子液在使用前将OD600调整至约1.2。将2 g样品与170 mL Hutchinson无机盐培养基混合物置于250 mL锥形瓶中，121°C灭菌15分钟。冷却后，向每个锥形瓶中加入30 mL相应的种子液(对照组加入等体积无菌水)。用透气膜密封锥形瓶，在37°C、180 rpm的摇床中培养。每个处理设三个重复。在培养的第0、4、7、11和14天取样。取样时测量培养液的pH值。样品在4°C、5000 rpm离心5分钟，收集沉淀。冻干后的沉淀用于后续分析：(1) 测定木质纤维素组成；(2) 使用扫描电子显微镜(SEM)观察表面微观结构的变化；(3) 通过结晶度测量和化学键与官能团的光谱分析(FTIR)评估结构变化，从而系统评估纤维素降解情况。
2.5. 不同复合生物添加剂对真菌状蒺藜草青贮效果的评估
菌悬液添加剂的制备：将两次活化的菌株JC2、JC3和JC28接种至LB-CMC液体培养基。37°C培养1天并测量OD590值。当OD590达到1.5时，在4°C、8000 rpm离心5分钟。然后用1 M PBS缓冲液洗涤沉淀2-3次。最后用去离子水将菌悬液OD590调至0.5。
采用完全随机析因设计，设立五个处理组：(I) CK(自然发酵)；(II) FH组(0.25 g半纤维素酶 + 0.25 g纤维素酶 + JC2、JC3、JC28各0.25 × 106cfu g-1FW)；(III) S组(1 g青贮接种剂)；(IV) Q组(JC2、JC3和JC28菌株各0.33 × 106cfu g-1FW)；(V) M组(0.5 g半纤维素酶和0.5 g纤维素酶)。
将添加剂与300 g真菌状蒺藜草手动混合直至完全混匀。然后将混合物放入20 × 30 cm聚乙烯真空发酵袋中。使用真空封口机抽除空气并密封。在25°C黑暗条件下储存。在发酵过程的第7、14、30、45和60天取样分析。实验采用五个处理，每个处理设三个重复对应五个取样时间点，总共需要75个独立的发酵袋(5处理 × 5时间点 × 3重复)。每个袋被随机分配到不同的取样点进行收集，样品用于分析青贮的发酵指标和营养成分。
2.6. 感官品质评价与发酵质量分析
感官品质评价依据德国农业协会制定的感官青贮判断方法和分级标准进行。本研究从气味、色泽和结构三个方面评价混合青贮饲料。
将青贮样品与去离子水按1:9比例混合，在4°C提取24小时。提取液用纱布和滤纸过滤，然后使用pH计测量pH值。将独立的青贮样品冷冻干燥，然后分析其营养成分。干物质(DM)采用AOAC方法分析。粗蛋白(CP)含量采用凯氏定氮法测定。水溶性碳水化合物(WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法测定。中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和酸性洗涤木质素(ADL)含量采用Van Soest等方法分析。氨态氮(NH4+-N)含量采用伯特洛反应(苯酚-次氯酸盐法)测定。
有机酸，包括乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)和丁酸(BA)，采用高效液相色谱法(HPLC)检测和定量。HPLC系统配备折光检测器和Shodex Rspark KC-811色谱柱(8.0 mm × 300 mm)，柱温箱温度50°C。使用的洗脱液为3 mM HClO4，流速为1 mL min-1。分析前，样品在4°C、10,000 rpm离心10分钟，然后用超纯水稀释上清液。随后，样品经0.22 μm孔径过滤器过滤至玻璃小瓶中。
2.7. 统计分析
所有实验数据使用Excel 2019整理，使用Origin 2018绘图，并通过SPSS 27.0统计软件进行双向方差分析。当检测到显著的主效应或交互作用(p < 0.05)时，采用Duncan多重比较检验进行事后比较。所有数据在分析前均进行了正态性和方差齐性检验。所有数值以平均值±标准差报告，显著性水平设定如下：p值< 0.05表示差异显著，p值> 0.05表示差异不显著。每个发酵袋为一个实验单元。
采用模糊数学中的隶属函数值法对不同真菌状蒺藜草青贮处理进行综合评价。DM、CP、WSC、LA和AA与真菌状蒺藜草青贮质量正相关，而pH、NH4+-N、NDF、ADF、ADL、CL、HL、PA和BA则负相关。使用公式计算每个指标的隶属函数值。对于正相关指标，使用公式(1)；对于负相关指标，使用公式(2)。其中RXi是某个指标的隶属函数值，Xi是该指标的测量值，Xmax和Xmin分别是该指标的最大值和最小值。
3. 结果
3.1. 分离与纯化
从自然枯萎的真菌状蒺藜草样品中分离出72株形态各异的菌株。通过刚果红试验、苯胺蓝脱色试验和滤纸降解试验，筛选出10株强健菌株进行进一步评估。刚果红试验确定JC28、JC3和JC2的降解能力最强。在苯胺蓝试验中，JC1、JC2、JC3、JC4和JC28在第1天显示出脱色区；JC2和JC28在第4天实现完全脱色，随后JC3在第5天完全脱色。在为期7天的滤纸降解试验中，JC2从第4天开始崩解，且JC2、JC3和JC28均表现出较强的降解能力，排序为JC2 > JC3 = JC28。
10株菌的纤维素酶活性测定显示，CMCase、FPase和β-葡萄糖苷酶活性存在显著差异(p < 0.05)。JC2、JC3和JC28表现出较高的CMCase和FPase活性，与滤纸试验结果一致。JC2显示出较高的CMCase(0.766 U mL-1)和FPase(1.083 U mL-1)活性。因此，最终筛选出三株高效纤维素降解菌株——JC2、JC3和JC28。
3.2. 纤维素降解菌株的鉴定
选定的菌株JC2、JC3和JC28在LB平板上生长旺盛。JC2菌落呈乳白色，色泽均匀，表面干燥，质地不粘，边缘有不规则的明显褶皱。JC3菌落呈淡黄色，干燥，整体凸起，中心隆起，边缘呈圆顶状斜坡。JC28菌落呈圆形，干燥，边缘略有皱纹，与JC2相似。三株菌均为革兰氏阳性杆菌。根据形态和镜检结果，JC2、JC3和JC28被初步归类为芽孢杆菌属(Bacillus spp.)。随后，对其16S rDNA基因进行PCR扩增，分别得到1449 bp、1453 bp和1447 bp的片段。NCBI BLAST分析表明，JC2、JC3和JC28的序列分别与Bacillus velezensis、Bacillus altitudinis和Bacillus tequilensis具有高度相似性。使用MEGA 11.0构建了16S rDNA的系统发育树，包括这三株菌及其9-10个最近的亲缘种。采用1000次重复进行Bootstrap验证以确保统计可靠性。基于全面的形态学、生理学和分子证据，JC2、JC3和JC28被明确鉴定并命名为Bacillus velezensis JC2、Bacillus altitudinis JC3和Bacillus tequilensis JC28。
3.3. 菌株对真菌状蒺藜草木质纤维素的影响
在发酵初期，CTL和JC2的生长速度明显快于CBV。然而，CBV直到第11天才表现出明显的木质素-纤维素降解，其总降解量仅为JC2的53.4%。
扫描电镜结果显示，CBV和JC2对真菌状蒺藜草造成的损伤明显大于CTL。早在第7天，就观察到JC2和CBV处理导致真菌状蒺藜草表面明显破碎，而CTL处理直到第11天才检测到此类损伤。发酵14天后，JC2、CBV和CTL组的纤维素残留量分别为35.82%、36.73%和35.06%。JC2的降解率高于CBV，略低于CTL。就总降解量而言，JC2是CBV的1.62倍，仅比CTL低1.6%。
3.4. 菌株对结晶度、化学键和官能团的影响
XRD分析表明，纤维素的基本晶体结构在发酵过程中得以保持。然而，结晶指数发生了变化；JC2和CBV均呈现逐渐下降趋势，且JC2下降更多。在发酵第7天，JC2处理组的结晶指数为48.81%，低于CBV(51.77%)。第14天，JC2和CBV结果相似，均高于CTL(47.55%)。
根据红外光谱吸收峰以及真菌状蒺藜草木质纤维素发酵前后傅里叶变换红外光谱(FTIR)吸收峰的显著变化，表明纤维的化学结构在发酵过程中发生了改变。FTIR结果显示，在3550-3200 cm-1范围内的吸收带在3421 cm-1处出现峰，这与氢键结合的羟基的O-H伸缩振动有关。该峰强度的显著降低归因于纤维素的酶解和降解。1635 cm-1和1515 cm-1处的吸收峰分别归属于芳香环的C=C伸缩振动和木质素中的芳香骨架振动。这些峰的减弱表明木质素的芳香环结构被破坏，可能是由于菌株产生的酶降解了芳香环所致。897 cm-1处的峰代表纤维素β-1,4-糖苷键，表明键的断裂以及氢键和结晶区的破坏，松散了纤维结构。1318 cm-1处的峰对应于木质素的烷基-芳基醚键和愈创木酚结构，整体呈下降趋势，证实了各菌株的木质素降解能力。
3.5. 不同添加剂对真菌状蒺藜草青贮感官品质评价与发酵质量分析
如结果所示，在使用不同添加剂进行60天青贮发酵后，FH组的感官评价总分最高(19分，一级优)，CK组较低。FH组和M组的色泽评分较高。CK组的气味、结构和色泽评分较低。
结果显示，不同处理组(T)对混合青贮的pH、WSC和CP含量存在极显著差异(p < 0.01)；不同发酵时间(D)对pH、DM、WSC和CP含量也存在极显著差异(p < 0.01)。处理组与发酵时间的交互作用(T × D)对混合青贮的pH、WSC和CP含量表现出极显著差异(p < 0.01)。随着发酵时间的延长，各组混合青贮饲料的pH、DM和WSC呈下降趋势，而CP含量在发酵过程中呈波动下降趋势。
在每个时间点，各处理组间的pH存在显著差异(p < 0.05)，CK组的pH值始终最高，而FH组在第60天记录的pH最低，显著低于其他组(p < 0.05)。发酵7天时，各组DM含量存在显著差异，CK组显著高于S组(p < 0.05)。14天后，所有处理组的DM含量均显著下降，到第60天，FH组的DM含量显著高于S组(p < 0.05)。在每个时间点，所有组的WSC含量均显示出显著的动态变化。第14天时，FH组和M组显著高于CK组(p < 0.05)，到第60天，FH组的WSC含量最高，显著超过其他组(p < 0.01)。各阶段组间CP含量存在显著差异，第7天时S组和M组显著高于CK组(p < 0.01)。30天后，所有组的CP含量趋于下降，到第60天，M组的CP含量最高，显著超过CK组和S组(p < 0.05)。
根据7-60天青贮样品的营养成分分析显示，不同处理组(T)对混合青贮的ADF和HL含量有显著或极显著影响(p < 0.05)。不同发酵时间(D)对混合青贮的NDF、ADF、HL和CL含量有极显著影响(p < 0.01)，而对ADL的影响不显著(p = 0.22)。处理组与发酵时间的交互作用(T × D)对混合青贮的ADF、HL和CL含量有显著或极显著影响(p < 0.05或p < 0.01)。随着发酵时间的延长，总体趋势显示所有组的混合青贮中NDF和ADF含量下降。
在不同时间点，发酵早期组间NDF差异相对较小。到第14天，M组的NDF显著低于其他组(p < 0.05)并保持相对稳定。CL含量在发酵早期S组和Q组较高，但总体上随着发酵时间的延长呈下降趋势。到第60天，组间CL含量存在显著差异(p < 0.05)，FH组和CK组的值相对较高。
对有机酸含量的进一步分析表明，不同处理组间LA、AA、PA和BA的含量存在极显著差异(p < 0.01)。此外，不同发酵时间对混合青贮中四种有机酸的含量也显示出极显著差异(p < 0.01)。处理方法与发酵时间的交互作用对所有指标均有显著影响，达到极显著水平(p < 0.01)。在每个时间点，随着发酵时间的延长，所有组的LA含量呈上升趋势。发酵第7天，M组的LA含量最高，显著高于其他组(p < 0.01)。到第60天，FH组和M组的LA含量显著高于其他组(p < 0.05)。随着发酵时间延长，所有组的AA含量总体呈上升趋势。发酵第7天，CK组的AA含量显著高于其他组(p < 0.05)。到第60天，CK组的AA含量最高，显著高于S组和Q组(p < 0.01)。随着发酵时间的延长，所有配比中PA的含量呈增加趋势。发酵14天时，CK组的PA含量显著高于其他组(p < 0.01)。到60天时，CK组和M组的PA含量最高，显著超过FH、S和Q组(p < 0.05)。随着发酵时间的增加，所有组的BA含量也呈现上升趋势。发酵7天时，CK组的BA含量最高，显著
