《Viruses》：Identification of Novel B Cell Epitopes on the Nucleocapsid Protein of Porcine Epidemic Diarrhea Virus
Ruiying Wang,
Meng Zhong,
Ye Liu,
Zichen Gao,
Jianing Hu,
Haiyan Zhang,
Qingtao Liu,
Bin Zhou and
Xiuli Feng
编辑推荐：
本文聚焦猪流行性腹泻病毒（PEDV）核衣壳（N）蛋白的抗原表征。研究通过原核表达、小鼠免疫及杂交瘤技术，成功制备了三株针对PEDV N蛋白的单克隆抗体（mAbs），并鉴定出两个新型线性B细胞表位71SNWHF75和66RIEQP70。生物信息学分析显示，这两个表位在PEDV不同毒株间高度保守，且与其他冠状病毒N蛋白无交叉反应性。本研究所获的高特异性mAbs与新型表位，为开发PEDV特异性诊断试剂和亚单位抗原疫苗提供了关键的实验材料与理论基础。
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种急性、高度传染性的肠道疾病，对全球养猪业造成重大经济损失。PEDV的核衣壳（N）蛋白在病毒感染和复制过程中起着关键作用，其序列在不同毒株间高度保守，是病毒颗粒和感染细胞内含量最丰富的蛋白。针对N蛋白的抗体在猪感染PEDV后早期即可产生，使其成为早期感染检测和诊断应用中的理想靶蛋白。N蛋白还在病毒转录、抑制宿主I型干扰素产生、调控宿主细胞周期等方面发挥多重功能。然而，现有疫苗的交叉保护力不足及诊断特异性有限，是当前PEDV防控面临的主要挑战。因此，鉴定N蛋白中的新型B细胞表位，对于开发更优的PEDV诊断和疫苗工具，以及研究病毒感染机制具有重要意义。
材料与方法
本研究所用的PEDV分离株由南京农业大学周斌教授惠赠。SP2/0和Vero细胞在添加相应浓度胎牛血清（FBS）和抗生素的培养基中培养。研究首先根据GenBank中PEDV N基因的序列设计引物，通过聚合酶链式反应（PCR）从病毒cDNA模板中扩增出全长N基因，并将其克隆至原核表达载体pET-32a(+)中，构建重组质粒pET-32a-N。将重组质粒转入表达宿主菌，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹分析确认表达。重组N蛋白随后在天然条件下通过镍-次氨基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析进行纯化，并使用BCA法测定其浓度。
将纯化的重组N蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，皮下多点注射免疫5-6周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠注射100μg N蛋白。在随后的第二、第三次免疫中，蛋白与弗氏不完全佐剂（FIA）乳化。免疫间隔为两周。最后一次免疫一周后采集小鼠血清，通过间接酶联免疫吸附测定（ELISA）测定抗原特异性抗体效价。选择抗体效价较高的小鼠，在无佐剂情况下注射200μg抗原进行最终加强免疫，以增强免疫应答。
最终免疫三天后，分离免疫小鼠的脾细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG）4000作用下进行融合。融合后的细胞在HAT选择培养基中培养。融合后10天收集培养上清，通过间接ELISA筛选针对N蛋白的特异性抗体，鉴定阳性杂交瘤克隆。通过四轮有限稀释亚克隆，建立了三株稳定的杂交瘤细胞系，分别命名为1A3、1G1和1A10。通过腹腔注射至BALB/c小鼠体内制备腹水，以批量生产单克隆抗体（mAbs）。使用商品化的小鼠mAb同型鉴定试剂盒鉴定所得mAbs的同型，结果显示三种mAbs均为IgG1亚型，轻链为κ型。通过蛋白质印迹分析和间接免疫荧光测定（IFA）进一步确认了mAbs的特异性。
结果
1. 重组PEDV N蛋白的表达与纯化
全长PEDV N基因成功通过PCR扩增，并经琼脂糖凝胶电泳证实扩增片段大小约为1326 bp。重组质粒pET-32a-N经双酶切验证，证实N基因片段正确插入。SDS-PAGE分析显示，重组蛋白分子量约为66.6 kDa，并主要在可溶部分表达。通过PEDV阳性猪血清进行的蛋白质印迹分析，在预期分子量处检测到特异条带，证实了其抗原特性。重组N蛋白随后通过镍亲和层析纯化，在100-150 mM咪唑浓度下收集的洗脱组分经SDS-PAGE分析，显示出对应于目标蛋白的单一主条带。最终蛋白浓度经BCA测定为0.399 mg/mL。
2. 抗N蛋白单克隆抗体的产生与鉴定
通过间接ELISA测定免疫小鼠的血清抗体水平，选择抗体效价最高的小鼠4号用于杂交瘤制备。在细胞融合和四轮有限稀释亚克隆后，通过使用重组蛋白和载体蛋白作为包被抗原的间接ELISA，筛选出三株能稳定分泌N蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞系1A3、1A10和1G1。蛋白质印迹分析证实，这三株mAbs的杂交瘤培养上清能与PEDV感染的Vero细胞裂解液中约55 kDa处的病毒N蛋白特异性条带发生反应。此外，IFA结果也显示，所有三株mAbs均能对PEDV感染的细胞产生强反应，证实了它们识别细胞环境中天然N蛋白的能力。
3. PEDV N蛋白上线性B细胞表位的精细定位
为了定位筛选出的mAbs 1A3、1A10和1G1所识别的表位，研究逐步构建了一系列六个截短的N蛋白片段和两个合成肽。首先，将N基因截断为两个片段：N-1和N-147，并将其克隆至p3xFLAG-CMV-7.1载体中进行真核表达。蛋白质印迹分析显示，三种mAbs均能识别N-1蛋白。为了进行更精细的定位，构建了两个更短的片段N-98和N-49，并克隆到原核表达载体pEGX-4T-1中。三种mAbs均能识别这两个重组蛋白。随后，构建了更短的片段N-82和N-65，蛋白质印迹证实所有mAbs均能识别N-82和N-65片段。
为确定最小表位，合成了两个重叠的肽段66RIEQPSNWHF75和71SNWHFYYLGTG82，并将其与牛血清白蛋白（BSA）偶联。蛋白质印迹分析表明，肽段66RIEQPSNWHF75能被mAbs 1A3、1G1和1A10识别，而肽段71SNWHFYYLGTG82能被mAbs 1A3和1G1识别。这些结果表明，mAbs 1A3和1G1识别的核心表位可能集中在氨基酸残基71SNWHF75上，而mAb 1A10主要识别残基66RIEQP70。
4. 所鉴定B细胞表位的保守性分析
为评估mAbs 1A3和1G1所识别表位的保守性，对不同的PEDV亚型和多种冠状病毒进行了同源性分析。结果显示，表位66RIEQP70和71SNWHF75在分析的所有72株PEDV毒株的N蛋白中都存在，表明这两个表位在PEDV内部高度保守。相比之下，对不同冠状病毒相应蛋白序列的比对则显示，这两个表位区域存在显著差异。
5. 所鉴定表位的空间定位预测
基于DNAstar Lasergene 11.1软件的预测，PEDV N蛋白的表位71SNWHF75主要位于由β-折叠组成的规则结构内。66RIEQP70和71SNWHF75均位于具有高抗原指数和高亲水性的区域。利用PyMOL2.6软件，基于AlphaFold 3预测的N蛋白三维结构，分析了两个表位的空间定位。预测显示，表位66RIEQP70位于蛋白表面，而表位71SNWHF75则部分埋藏在内部，这一发现与DNAstar的预测结果一致。
讨论
近年来，PED已成为养猪业的严重威胁。虽然早期疫情主要与经典毒株有关，但当前流行的毒株经常表现出遗传变异。基于经典毒株CV777的传统疫苗在中国的保护效果有限，凸显了对精确的PEDV早期诊断技术和新型疫苗的迫切需求。PEDV的S蛋白是暴露在病毒表面的糖蛋白，可诱导产生对病毒中和至关重要的中和抗体。相比之下，N蛋白位于病毒颗粒内部，针对N蛋白的抗体缺乏中和活性。然而，S蛋白在不同PEDV毒株间具有高度的遗传变异性，这限制了其作为广谱诊断靶点的适用性。PEDV N蛋白在病毒感染过程中含量丰富、免疫原性高且高度保守，是诊断开发的理想靶点，凸显了表征N蛋白特异性mAbs及其表位的重要性。
本研究中，通过原核表达和纯化了PEDV N蛋白，并用其从免疫小鼠中制备了三株单克隆抗体。通过蛋白质印迹和IFA证实，这些mAbs能特异性结合天然N蛋白。采用顺序截短和合成肽的详细表位作图策略，鉴定出两个新型线性B细胞表位：66RIEQP70和71SNWHF75。这些表位在包括流行的GII基因型在内的不同PEDV毒株间高度保守，但在其他冠状病毒的相应同源区域则存在显著差异。从应用角度看，如此高特异性的单克隆抗体对PEDV的临床诊断具有重要价值。
为将新发现的表位置于PEDV N蛋白已知抗原图谱的背景下，本研究将表位66RIEQP70和71SNWHF75的分布与先前报道的表位进行了比较。分析表明，表位66RIEQP70位于N蛋白的N端结构域内，该区域已知包含多个线性表位。虽然包含66RIEQP70的重叠肽段在早期研究中曾被提及，但表位71SNWHF75作为一个独立的功能性线性表位，此前尚未被系统鉴定或功能验证。因此，71SNWHF75代表了一个先前未报道的新型线性表位。
在本研究中，结构建模揭示，表位66RIEQP70暴露在蛋白质表面，而71SNWHF75虽部分埋藏，但仍保持有利的溶剂可及性。值得注意的是，获得的三株单克隆抗体靶向N蛋白66-75区域内两个相邻的线性表位。该区域表现出高亲水性和高抗原指数，这可能代表了小鼠免疫反应中的一个免疫优势特征，导致其被多个独立的B细胞克隆所靶向。
在未来的研究中，将基于冠状病毒的比较序列比对，进一步研究这三株单克隆抗体的特异性，以确认其对PEDV的高度特异性，并消除与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及其他相关病毒潜在的交叉反应性，这些病毒在临床诊断中常引起混淆。最终，这些经过充分表征的mAbs将作为生物试剂，用于开发仅针对PEDV的特异性诊断方法。
总而言之，本研究利用逐步截短的策略，提供了三株经过充分表征的mAbs，并定义了两个新型、保守的线性B细胞表位。这些发现为开发基于表位的PEDV诊断方法和进一步研究N蛋白的功能作用提供了宝贵的工具和见解。
