《Viruses》：Viral Metagenomic Analysis Reveals High Prevalence of Dromedary Camel Bocavirus and Porcine Astrovirus in Bactrian Camel Intestinal Tissue
Yi Zhang,
Xiaojun Ding,
Xinyu Tao,
Nuermaimaiti Tuohuti,
Xinhao Wang,
Ailixire Maimaiti,
Zhanqiang Su and
Xuelian Ma
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本项研究采用病毒宏基因组学方法，首次系统揭示了中国新疆地区双峰骆驼肠道组织中丰富的病毒多样性。研究发现，单峰骆驼博卡病毒（DBoV1）和猪星状病毒5型（PoAstV5）是其中最普遍存在的病毒，分子流行病学调查进一步证实了其在骆驼群体中的广泛传播。该研究不仅拓宽了我们对骆驼肠道病毒谱的认知，更重要的是首次在双峰骆驼中检测到猪源病毒（PoAstV5），为跨物种传播（cross-species transmission）和潜在的人畜共患病风险提供了关键数据，对管理骆驼肠道疾病、保障畜牧业健康具有重要科学价值。
1. 引言
双峰骆驼（Camelus bactrianus）是干旱地区具有重要经济价值的家畜。然而，与已得到较多关注的呼吸道病毒（如中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV）相比，其肠道病毒组（intestinal virome）仍属研究空白。肠道病毒可能与骆驼常见的腹泻等胃肠道疾病相关，造成经济损失。传统病毒检测方法依赖于已知序列，存在局限。本研究采用不依赖已知序列的病毒宏基因组学（viral metagenomics）技术，旨在系统揭示新疆地区双峰骆驼肠道组织中的病毒种群，识别主要病原体，评估其流行病学分布，为骆驼病毒性疾病防控及人畜共患病风险评估提供依据。
2. 材料与方法
2.1. 样本采集
研究于2023年从新疆不同地区、季节和品种的双峰骆驼中收集了261份肛拭子样本，用于分子流行病学调查。其中，南疆69份，北疆192份；春夏季110份，秋冬季151份。样本主要来自出现黄色水样腹泻症状的幼驼（3-12月龄）。此外，同年8月，从乌鲁木齐市SL1大型骆驼场一头死亡骆驼的十二指肠无菌解剖获取了2-3 cm组织样本，用于病毒宏基因组学分析。
2.2. 组织病理学分析
对患病肠道组织进行石蜡包埋、切片和苏木精-伊红（H&E）染色，在40倍光学显微镜下观察。结果显示肠道正常结构被破坏，存在多处出血灶（），固有层有明显淋巴细胞和浆细胞浸润，肠绒毛丢失，组织结构退化，提示存在可能与病毒感染相关的严重肠炎。
2.3. 病毒宏基因组学测序与分析
对肠道组织样本进行核酸提取，构建DNA和RNA文库，在NovaSeq 6000平台上进行PE150测序。原始数据经质量控制和去宿主、去细菌序列处理后，获得高质量读长。利用Kraken2等工具对病毒序列进行物种分类注释。
2.4. 病毒验证与分子流行病学
基于测序结果，针对DBoV1的NS1基因和PoAstV5的ORF1a基因保守区设计引物，对261份肛拭子样本进行PCR/RT-PCR验证，以确定其流行率，并分析其与地区、季节的相关性。
2.5. 系统发育与遗传进化分析
对鉴定出的DBoV1 NS1基因和PoAstV5 ORF1a基因序列，从GenBank下载参考序列，使用MEGA软件构建最大似然法系统发育树。利用RDP4和SimPlot软件评估重组事件。使用MegAlign软件计算核苷酸同源性。
3. 结果
3.1. 肠道病毒组概览
病毒宏基因组测序共获得87,381条重叠群，其中1,470条（≥1000 bp）被鉴定为病毒序列。哺乳动物病毒占病毒重叠群的98.06%。在哺乳动物病毒中，相对丰度前五的病毒科为：细小病毒科（Parvoviridae， 79.55%）、星状病毒科（Astroviridae， 6.70%）、布尼亚病毒科（Bunyaviridae， 6.53%）、雀麦花叶病毒科（Bromoviridae， 5.28%）和小RNA病毒科（Picornaviridae， 1.94%）。其中，细小病毒科中以单峰骆驼博卡病毒（DBoV1）最为丰富，星状病毒科中以猪星状病毒5型（PoAstV5）最为突出。
3.2. DBoV1与PoAstV5的分子流行病学分析
对261份肛拭子的PCR/RT-PCR分析显示，DBoV1的总阳性率为36.40%（95/261），显著高于PoAstV5的26.44%（69/261）。地区分析显示，DBoV1在新疆北部和南部的感染率无显著差异；而PoAstV5在北疆的感染率（31.25%）显著高于南疆（13%）。季节分析表明，两种病毒的感染率在春夏季与秋冬季之间均无显著差异。
3.3. DBoV1与PoAstV5的遗传进化分析
3.3.1. DBoV1 NS1基因分析
从DNA病毒池中组装得到一条包含完整NS1基因的DBoV1序列，命名为DBoV1/Chin/XJ-WLMQ/2023。系统发育分析显示，该序列与一株国内骆驼源毒株（OM892340.1）亲缘关系最近。重组分析未检测到重组事件。
3.3.2. PoAstV5 ORF1a基因分析
从RNA病毒池中组装得到一条包含完整ORF1a基因的PoAstV5序列，命名为PoAstV5/Chin/XJ-WLMQ/2023。系统发育分析表明，该序列与一株2017年的猪源毒株（ON792973.1）亲缘关系最近。重组分析未在ORF1a基因中发现重组证据。
3.3.3. 同源性分析
DBoV1 NS1基因与国内外骆驼源DBoV1毒株核苷酸同源性最高（94.2%-97.6%），与来自人、大猩猩、蝙蝠等其他宿主的博卡病毒同源性较低（44.8%-51.8%）。PoAstV5 ORF1a基因与猪源PoAstV5毒株同源性高（92.3%-92.7%），而与其他基因型的星状病毒同源性低（22.9%-28.4%）。
4. 讨论
本研究利用病毒宏基因组学揭示了新疆双峰骆驼肠道中复杂的病毒群落。DBoV1作为已知的骆驼病毒，其高检出率（36.40%）和丰度（占哺乳动物病毒重叠群79.55%）表明它可能是骆驼肠道中的一种常见病毒。而PoAstV5的发现则令人意外，这是该病毒在双峰骆驼中的首次报道。考虑到研究地区为伊斯兰文化区域，周边无猪场等直接污染源，且实验过程严格去污染，这一发现强烈提示了跨物种传播事件的可能。PoAstV5属于哺乳动物星状病毒（Mamastrovirus），是典型的肠道病原体，具有跨物种传播潜力。
研究还检测到雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）等植物相关病毒，可能与骆驼食入植物携带的昆虫有关。布尼亚病毒科（Bunyaviridae）虽有较高丰度报告，但未获得相应序列，可能为样本处理假象，需进一步验证。
DBoV1的高流行率此前未见报道，其在骆驼死亡复杂背景下的致病性需谨慎评估。作为博卡病毒，它可能在极端气候、营养缺乏或混合感染等情况下作为原发性或协同致病因子。PoAstV5的首次检出及其相对较高的流行率，则凸显了阐明其临床影响的必要性。星状病毒感染可能损害肠道健康和营养吸收，或在一定条件下引发显性胃肠炎，削弱宿主，间接增加死亡风险。未来需要通过纵向队列研究、建立感染模型等方式，系统揭示这些病毒的直接致病潜力，并结合养殖管理实践识别风险因素。
5. 结论
本研究首次运用病毒宏基因组学在中国新疆双峰骆驼肠道中鉴定出单峰骆驼博卡病毒（DBoV1）和猪星状病毒5型（PoAstV5），并证实了二者在骆驼群体中的广泛传播。这勾勒了双峰骆驼肠道病毒组的轮廓，加深了对病毒多样性的理解。尤为重要的是，PoAstV5的发现为跨物种传播研究提供了新案例。研究成果为监测和预防骆驼病毒性疾病提供了科学依据，为未来骆驼病毒学研究奠定了基础。
