《Agronomy》：Phenotypic and Physiological Characterization of Rice Recombinant Inbred Lines with Enhanced Drought Tolerance at Vegetative and Reproductive Stages
Suman Kumar Paul,
Mohammad Nurul Matin,
Muhammad Fazle Rabbee,
Md. Shahadat Hossain,
Md. Sabbir Ahamed,
Md. Atik Mas-ud,
Md. Rayhan Chowdhury and
Kwang-Hyun Baek
编辑推荐：
本篇综述系统评估了由高产品种BRRI-28与商品种BINA-7杂交培育的水稻重组自交系（RILs）的抗旱表现。通过整合形态、生理、生化及解剖学分析，研究发现RIL-3在干旱胁迫下展现出卓越的农艺性状、独特的生理响应（如叶绿素保持、低脯氨酸积累）以及发达的根通气组织形成，其综合抗旱性优于亲本，并与已知抗旱品种BRRIdhan-56相当，为抗旱育种提供了有价值的基因型。
1. 引言
水稻(Oryza sativa L.)是全球主要的粮食作物，为超过三分之一的人口提供粮食安全和营养，供应了50-76%的膳食能量。然而，气候变化和全球变暖加剧了干旱对水稻生产的威胁。干旱是限制水稻遗传潜力、导致减产和经济损失的主要非生物胁迫之一。为了应对这些挑战，培育高产且抗旱的水稻基因型已成为未来研究的首要主题。通过基因型筛选、育种选择以及靶向可持续育种研究，有助于提高产量潜力。孟加拉国是水稻起源中心之一，大部分抗旱种质（占总抗旱种质的73%）源自该国，因此筛选孟加拉国水稻种质对于培育抗旱品种具有优势。植物通过调节形态、生理和生化过程来适应非生物胁迫，这些过程构成了胁迫耐受的基本机制。本研究旨在从BRRI-28和BINA-7杂交培育的F7代重组自bred系（RILs）中，通过整合形态、生理、生化和解剖学分析，筛选和鉴定在营养生长期和生殖生长期均具有增强抗旱性的水稻品系。
2. 材料与方法
2.1. 材料收集、栽培与筛选
研究在孟加拉国拉杰沙希大学遗传工程与生物技术系的分子遗传学实验室及水稻研究田间进行。以高产品种BRRI-28和商品种BINA-7为亲本，通过杂交和连续自交及表型选择，培育至F7代，获得遗传稳定的RILs。已知抗旱品种BRRIdhan-56作为对照基因型。通过谱系选择法，从F7代200个株系中，首先在田间正常灌水（WW）和适度干旱（DC）条件下评估主要农艺和产量相关性状，筛选出37个表型优异的RILs。随后使用聚乙二醇（PEG-6000）进行渗透胁迫筛选，最终选出3个表现优异的株系（RIL-1, RIL-2, RIL-3）进行后续控制性干旱评估。
2.2. 基于PVC管的圆柱栽培与干旱处理
选出的三个RILs及对照BRRIdhan-56在聚氯乙烯（PVC）管（高50厘米，直径18厘米）中栽培。在分蘖中期（移栽后60天）开始干旱处理，通过停止供水诱导干旱胁迫，持续23天直至处理植株叶片完全卷曲，之后复水。设置三个生物学重复，采用随机完全区组设计。
2.3. 表型性状测定
记录地上部性状，如分蘖数（TN）、株高（PH）、叶片卷曲状态、地上部鲜重（SFW）和干重（SDW）。实验结束后，测定根系性状，包括最大根长（MRL）、总根鲜重（TRFW）、深层根鲜重（DRFW）、总根干重（TRDW）、浅层根鲜重（SRFW）、深层根长（DRL）、浅层根干重（SRDW）、浅层根直径（SRD）、深层根直径（DRD）、深层根干重（DRDW）和节根数（NRN）。
2.4. 土壤含水量测定
从每根管的三个不同位置（深度15-30厘米）采集土壤样品，通过测量新鲜和干燥土壤的重量计算土壤含水量百分比。
2.5. 叶片和根系干物质估算
通过测量叶片和根系样品的鲜重（FW）和烘干后干重（DW），计算干物质百分比。
2.6. 叶片和根系相对含水量
通过测量叶片和根系样品的鲜重和干重，计算相对含水量（RWC）百分比。
2.7. 叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量估算
取200毫克新鲜叶片，用80%冷丙酮研磨离心，取上清液用紫外-可见分光光度计在645纳米和663纳米波长下测定吸光度，通过特定公式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量。
2.8. 叶片脯氨酸含量估算
采用酸性茚三酮法测定。用3%磺基水杨酸匀浆叶片样品，离心取上清液与酸性茚三酮和冰醋酸反应，用甲苯萃取后，在520纳米波长下测定吸光度，以L-脯氨酸为标准估算脯氨酸含量。
2.9. 根系解剖研究
收集处理和未处理的根系样品，用甲醛-醋酸-酒精（FAA）溶液固定，制作薄横切片，用番红染色，在光学显微镜下观察。手动从显微照片评估根系通气组织空间。
2.10. 形态数据统计分析
使用标准统计方法评估形态数据变异性，包括均值、范围、表型和基因型方差以及变异系数。使用IBM SPSS Statistics软件（版本26）进行单因素方差分析（ANOVA），在5%显著性水平（p<0.05）下使用最小显著差数（LSD）检验进行均值分离。
3. 结果
3.1. RILs在田间和控制干旱条件下的筛选与表型评价
在田间正常灌溉和适度干旱胁迫下，对200个F7代RILs及其亲本进行了评估。多数性状在两种条件下均观察到显著变异。亲本在适度干旱下表现下降，而多个RILs在不同环境下保持稳定表现。值得注意的是，RIL-3在干旱胁迫下未表现出产量损失，与亲本相比，保持了更高的分蘖数、穗部特性、种子结实率和百粒重。基于整体表型优越性和抗旱性（表现为较低的叶片卷曲评分和无萎蔫症状），筛选出37个RILs。随后通过PEG-6000诱导的渗透胁迫筛选，从中鉴定出三个有前景的株系（RIL-1, RIL-2, RIL-3）用于PVC管控制性干旱评估。
3.2. 干旱胁迫下的存活率、叶片卷曲、根系和穗部特征
干旱处理后，定期监测植株萎蔫和叶片卷曲直至停止供水后第23天。干旱胁迫显著降低了植株存活率。除对照和RIL-3外，其他基因型严重萎蔫，接近死亡。在正常灌水条件下，任何基因型均未观察到植株受损；而在干旱条件下，BRRI-28（P1）在胁迫第10天、BINA-7（P2）在第17天开始出现受损。对照品种BRRI-56和RIL-3在整个23天干旱期内均无植株死亡。在干旱胁迫条件下，所有基因型的最大根长（MRL）均显著增加。在正常灌水下，任何基因型均未观察到叶片卷曲；而在干旱下，BRRI-28（P1）在第10天、BINA-7（P2）在第17天首次出现叶片卷曲，RIL-1和RIL-2分别在第16天和第21天出现。对照品种BRRI-56和RIL-3在整个23天干旱期内均无叶片卷曲。在正常灌水下，所有基因型的穗均能正常抽出，BRRI-56所需时间最短（91天），BINA-7最长（102天）。RIL-1、RIL-2和RIL-3分别在98、90和95天抽穗。然而，在干旱条件下，除BRRI-56（94天）和RIL-3（98天）外，大多数基因型和RILs完全未能抽穗。穗部形态显示，每穗次级分枝比初级分枝受到更严重的影响和减少，最终降低了粒数和产量。
3.3. 干旱胁迫下根系形态生理特征的变化
与正常灌水条件相比，所有基因型在干旱条件下的最大根长（MRL）、深层根长（DRL）、深层根直径（DRD）、深层根鲜重（DRFW）和深层根干重（DRDW）均显著增加。最长的MRL（61.40厘米）和最高的DRL（31.40厘米）出现在BRRI-28，其次是RIL-3。另一方面，节根数（NRN）、总根鲜重（TRFW）、总根干重（TRDW）、浅层根直径（SRD）、浅层根鲜重（SRFW）和浅层根干重（SRDW）在干旱条件下均下降。最高的TRFW（24.11克）和TRDW（6.51克）出现在BRRI-28，其次是RIL-1。RIL-1表现出最高的SRFW（16.75克），而BRRI-28记录了最大的SRDW（5.07克）。最高的SRD（7.20厘米）和NRN（192.33）出现在RIL-1，其次是RIL-3。
3.4. 干旱胁迫下的土壤含水量
在所有基因型中，与正常灌水对照相比，干旱条件下的土壤含水量（SMC）显著下降。然而，这种减少在亲本中比在后代和对照中更为明显。在干旱条件下，对照品种BRRI-56的SMC最高（28.22%），其次是后代之一RIL-3（20.53%）。
3.5. 相对含水量及相对地上部和根系干物质
与正常灌水条件相比，干旱胁迫下所研究基因型的相对地上部含水量（SWC）显著下降。然而，BRRI-56和RIL-3的降幅相对较小。在干旱下，BRRI-56保持最高的SWC（77.93%），其次是RIL-3（63.25%），而BRRI-28最低（46.57%）。地上部干物质（SDM）百分比在干旱胁迫下高度增加。最高的SDM（53.43%）出现在BRRI-28，其次是BINA-7（47.76%），最低的是BRRI-56（22.07%），其次是RIL-3（36.75%）。在所研究的基因型中，根系含水量（RWC）百分比在干旱胁迫下增加。在正常灌水下，最高的RWC（78.76%）出现在BRRI-56，其次是BINA-7（76.38%），最低的是RIL-3（63.61%）；而在干旱下，最高的是RIL-2（78.64%），其次是BRRI-56。根系干物质（RDM）的相对百分比在干旱胁迫下下降。最高的RDM（26.99%）出现在BRRI-28，其次是RIL-3（23.87%）；而在正常灌水下，RIL-3表现出最高的RDM（36.39%）。
3.6. 干旱胁迫下叶片叶绿素和脯氨酸含量
与正常灌水条件相比，所有基因型水稻叶片的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在干旱条件下均下降。在正常灌水下，BRRI-56的叶绿素a含量最高（44.91毫克/克），其次是RIL-3（43.29毫克/克）。在干旱下，BRRI-56和RIL-3保持了相对较高的水平（分别为35.08和36.33毫克/克），而亲本记录的值最低。叶绿素b含量在所有基因型的干旱条件下也下降。在正常灌水下，BRRI-56的叶绿素b最高（58.20毫克/克），其次是RIL-3（53.50毫克/克），而BRRI-28最低（24.92毫克/克）。然而，在干旱下，最高的叶绿素b含量出现在BRRI-56（54.14毫克/克），其次是RIL-3（47.66毫克/克），而最低值13.48毫克/克出现在BRRI-28。所有基因型的叶片总叶绿素含量在干旱条件下也呈现出类似的下降模式。最大值（93.25毫克/克）出现在BRRI-56，其次是RIL-3（89.94毫克/克）。脯氨酸是一种多功能氨基酸，不仅参与植物发育过程，也参与非生物和生物胁迫响应。在干旱胁迫条件下，正常植物的叶片脯氨酸含量会增加以响应胁迫。在本实验中，在干旱下，BRRI-28的叶片脯氨酸含量增加幅度最大且最显著，其次是RIL-1和BINA-7，而BRRI-56和RIL-3在正常灌水与干旱条件下的增加可忽略不计，表明它们对干旱具有耐受性。
3.7. 根系解剖变异
根系结构和解剖表型对于适应干旱至关重要。在显微镜下研究了所有基因型在干旱和正常灌水条件下根横切面的解剖特征。最外层包含单细胞根被皮，接着是由多层皮层薄壁组织组成的皮层区域，最后是含有木质部和韧皮部的维管束。在正常灌水条件下，所有基因型均表现出比干旱条件更高的通气组织密度；然而，在干旱下，只有对照品种BRRI-56和RIL-3表现出比其他基因型更致密的通气组织。还手动检查了显微照片中由空气空间组成的区域（通气组织百分比），发现除对照和RIL-3外，其他基因型表现出更高的通气组织形成。BRRI-56和RIL-3在干旱下的结果与正常灌水下几乎相似。通常，抗旱品种在干旱条件下比感病品种具有更致密的通气组织。
3.8. 干旱胁迫下形态性状间的相关性
对干旱条件下地上部性状的相关性分析显示，脯氨酸与其他地上部性状，即地上部干重（r=0.727）、分蘖数（r=0.756）和地上部干物质百分比（r=0.690）呈显著正相关。此外，土壤含水量百分比（r=-0.677）、叶绿素a（r=-0.753）、叶绿素b（r=-0.803）、总叶绿素（r=-0.827）和地上部相对含水量百分比（r=-0.690）与脯氨酸呈显著负相关。这些结果表明脯氨酸含量与地上部性状紧密相关。关于干旱条件下的根系性状，最大根长与总根鲜重（r=0.676）、总根干重（r=0.730）、深层根长（r=1.000）、深层根鲜重（r=0.768）、深层根干重（r=0.697）、深层根直径（r=0.525）和根系干物质百分比（r=0.808）呈显著正相关。相比之下，浅层根相对含水量百分比（r=-0.800）与最大根长呈显著负相关。数据表明最大根长与这些根系性状密切相关。
4. 讨论
水稻对干旱的响应是复杂的，取决于生长阶段、基因型和胁迫持续时间。大多数水稻品种在幼苗期、营养生长期和生殖期对干旱胁迫极为敏感。生殖期的胁迫通常比营养生长期导致更严重的产量损失。尽管培育抗旱品种对可持续农业具有挑战性，但育种抗旱水稻品种是减轻水分限制不利影响的有前景的策略。抗旱性是一个复杂的性状，由不同形态、生化和生理响应的相互作用控制。某些RILs优于双亲的表现可能源于抗旱响应性状的有利重组和超亲分离。本研究的主要目的是从形态生理参数筛选重组自交水稻系，以鉴定抗旱品系。形态改变是水稻对干旱胁迫最早可见的响应之一。在本研究中，干旱胁迫下所有基因型的大多数地上部性状均降低。但所有RILs的性状幅度均高于对照品种BRRI-56。类似的地上部性状在干旱胁迫下的减少在多种水稻基因型中已有报道。穗长、每穗初级/次级分枝数、结实率和粒重在水稻中因干旱胁迫而显著降低。叶片特征如卷曲和早衰是典型的干旱诱导特征。干旱胁迫下的叶片卷曲是由于植物无法维持蒸腾作用，导致叶片膨压降低。在本研究中，叶片卷曲出现在亲本中，但未出现在对照品种BRRI-56和RIL-3中，直到处理第23天。与对照品种BRRI-56相比，RIL-3的抗旱潜力高于其他品系。干旱胁迫对穗发育构成严重威胁，尤其是在花序发育阶段。然而，这种严重性在感病品种中比在耐受品种中更为突出。在本实验中，干旱处理在花序发育期开始。因此，大多数基因型无法发育出功能性的穗，表明它们对干旱敏感。另一方面，只有对照和RIL-3在干旱下发育出穗，表明它们的耐受性。与对照品种BRRI-56相比，RIL-3的抗旱能力强于其他品系。根系性状，特别是根系系统和发育、根量和根长，是增强水稻干旱胁迫下产量的关键属性。基于田间的根系性状研究本身具有挑战性，因此有限。在本研究中，最大根长、深层根长、深层根鲜重、深层根干重和深层根直径增加，而总根鲜重、浅层根鲜重、总根干重、浅层根干重、浅层根直径和节根数在所有基因型的干旱胁迫下均下降。所有RILs表现出更高的深层根鲜重、总根鲜重、浅层根鲜重、总根干重、节根数和浅层根干重。只有RIL-3表现出比对照品种BRRI-56更高的最大根长、浅层根直径和深层根长。具有深且发达根系、多分枝的水稻品种在干旱中表现出更好的适应性。据报道，在干旱胁迫下，水稻根长和深层根直径增加，但浅层根鲜重、浅层根直径和浅层根干重减少，这与本研究的结果一致。之前的研究也报道了干旱胁迫下深层根性状增加和浅层根性状减少，与我们的观察一致。我们研究中的其他发现与之前报道的干旱胁迫下根系性状结果一致。所有基因型的土壤含水量百分比在干旱胁迫条件下下降。RILs显示出比BRRI-56更低的土壤含水量，但RIL-3除外，其结果几乎与BRRI-56相似。先前对印度东部浅层雨养生态系统的研究发现，干旱下土壤水分减少，这与本研究结果一致。在本研究中，地上部干物质百分比增加，根系干物质百分比在干旱胁迫条件下下降。大多数RILs显示出比对照品种BRRI-56更高的地上部干物质和根系干物质。在筛选高生物量水稻抗旱性时，有报道称地上部干物质百分比高度增加，根系干物质百分比在干旱胁迫下高度下降。在干旱胁迫条件下，地上部和深层根的相对含水量百分比下降，而总根和浅层根相对含水量百分比增加。RIL-3显示出与对照几乎相似的地上部相对含水量。另一方面，RILs显示出比BRRI-56更高的深层根相对含水量。类似的结果已在遭受PEG-6000诱导干旱胁迫的水稻幼苗中报道。通常，水分缺乏会降低叶肉细胞的功能，导致水稻植株叶绿素含量减少。叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在干旱条件下下降。RIL-3保持了比抗旱对照BRRI-56更高的叶绿素a水平。值得注意的是，RIL-3显示出更高的叶绿素a含量，并且叶绿素b和总叶绿素含量与对照品种BRRI-56几乎相似，这表明RIL-3比其他品系表现出更高的抗旱性。早期研究表明，叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在干旱条件下减少，与此发现一致。脯氨酸等相容性溶质的积累是植物对干旱胁迫广泛报道的适应性响应，通常与渗透调节、氧化还原缓冲、蛋白质和膜稳定以进行细胞保护以及活性氧（ROS）清除有关。脯氨酸合成通常在胁迫条件下增强，以减轻氧化损伤和稳定细胞结构。在本研究中，所有基因型的叶片脯氨酸含量在干旱胁迫下增加；然而，积累程度差异显著。亲本和RIL-1在干旱下表现出比正常灌水条件下 substantially更高的脯氨酸积累，表明更大的生理紊乱和胁迫敏感性。相比之下，RIL-3和抗旱对照品种BRRI-56尽管长期缺水，但仍保持了相对较低的脯氨酸积累。脯氨酸积累与抗旱性之间的这种反比关系表明，在耐受基因型中，较低的脯氨酸水平可能反映了优越的渗透调节和降低的胁迫感知，而不是较弱的胁迫响应。类似的结果已在水稻和其他作物中报道，其中感病品种在严重干旱下积累更高的脯氨酸浓度，而耐受基因型由于更有效的水分状况调节和代谢稳态而保持中等或稳定的水平。此外，先前的研究表明，脯氨酸积累受胁迫强度和持续时间的强烈影响，并且在复水后经常下降，这表明水稻中的脯氨酸积累可能作为干旱胁迫严重程度的潜在标志，而不是耐受性的直接决定因素。在干旱敏感品种中，过高的脯氨酸水平通常与严重的细胞损伤和形态生理发育迟缓同时发生。番茄叶片的脯氨酸含量与叶片的相对含水量密切相关，表明在干旱胁迫下，水分状况较好的番茄植株比严重受胁迫的植株积累更少的脯氨酸，结论是脯氨酸是施加在植物上的环境胁迫的可靠指标，其浓度反映了胁迫强度而非胁迫耐受性。研究发现，盐芥和厚叶独行菜在非胁迫条件下具有升高的脯氨酸水平，有综述认为，过度的脯氨酸积累通常是细胞损伤的症状而非适应性响应，脯氨酸并非适应极端环境条件的绝对要求。总的来说，这些发现支持了这样的观点：抗旱基因型中较低的脯氨酸积累，伴随着较高的相对含水量、叶绿素保持和稳定的根系解剖结构，可能表明在干旱条件下胁迫感知降低和生理恢复力增强，而不是较低的胁迫响应。相关性分析揭示了脯氨酸与地上部干重、分蘖数和地上部干物质等其他地上部性状之间的显著正相关。干旱条件下根系性状的相关性分析揭示了最大根长与总根鲜重、总根干重、浅层根鲜重、浅层根干重、深层根长、深层根鲜重、深层根干重、深层根直径和根系干物质等其他根系性状之间的显著正相关。这些结果表明脯氨酸积累与地上部表现密切相关，而最大根长与根系性状密切相关。先前的研究报道了水稻在干旱胁迫下株高、地上部鲜重、地上部干重、分蘖数、地上部干物质、最大根长、
