miR-let-7靶向ZcCTL-S1调控瓜实蝇雌性生殖发育的分子机制探究

《Insects》：miR-let-7 Targeting ZcCTL-S1 to Regulate Reproductive Development in Zeugodacus cucurbitae Yi-Kun Zhang, Guo-Feng Zhang, Li-Xiang Chen, Yu-Xue Zhang, Shi-Yuan Wang, Ke-Qing Deng, Lai-Wai Tun, Zhong-Shi Zhou and Lu Peng

本研究发现瓜实蝇（Zeugodacus cucurbitae）中miR-let-7靶向卵巢特异性基因ZcCTL-S1，形成关键的miRNA-基因调控模块，进而显著抑制卵孵化率、降低雌虫繁殖力。该成果首次揭示了C型凝集素（CTL）在瓜实蝇生殖中的非免疫功能，为基于基因或miRNA的害虫控制策略提供了新靶点与理论依据。

　　

引言

瓜实蝇（Zeugodacus cucurbitae）是全球范围内重要的检疫性害虫，严重危害葫芦科和茄科作物。其雌虫产卵于果皮下，幼虫取食果肉导致腐烂，造成严重的产量与品质损失。由于幼虫的特殊取食习性和成虫对化学农药的抗性，传统化学防治效果有限，且易引发环境污染与农药残留问题。因此，探索针对性的、环境友好的治理策略，特别是通过遗传手段抑制其繁殖潜力，对控制瓜实蝇种群增长至关重要。

C型凝集素（C-type lectins, CTLs）是动物凝集素家族中广泛分布的糖结合蛋白，具有Ca²⁺依赖的糖识别活性。在昆虫中，CTLs主要被认为在病原识别和免疫防御中发挥核心作用，其典型的C型凝集素结构域（CTLD）可识别脂多糖、肽聚糖等病原相关分子模式，从而触发免疫反应。然而，近期研究表明，CTLs介导的Ca²⁺依赖的糖识别也参与了昆虫卵巢成熟、配子结合和胚胎发育等多种生殖过程。在赤拟谷盗（Tribolium castaneum）中，TcCTL9的敲低会通过损害胚胎发生和免疫功能降低卵孵化率；在棉铃虫（Helicoverpa armigera）中，雌虫通过CTLs增强抗菌防御以支持成功受精。这些发现表明，CTLs不仅维持昆虫的免疫稳态，也通过多种机制深度参与生殖调控，这为害虫防治和生物技术应用提供了新视角。不过，CTLs家族中卵巢特异性成员是否通过上游调控因子（如微小RNA, miRNAs）来调控瓜实蝇的生殖发育，目前尚不清楚。

miRNAs是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA，作为基因表达的转录后调控因子发挥作用。它们不编码蛋白质，但可以通过靶向信使RNA（mRNA）来调控基因表达，主要机制包括mRNA降解和翻译抑制。积累的研究表明，miRNAs通过靶向调控特定基因，影响昆虫的核心生殖过程（如卵巢发育、卵子成熟和生殖细胞维持）。在橘小实蝇（Bactrocera dorsalis）中，miR-31b被实验证实靶向芳基硫酸酯酶B，从而改变代谢稳态并抑制卵巢发育；而在烟粉虱（Bemisia tabaci）中，敲低miRNA通路关键基因Ago1和Dcr1会降低miR-let-7和miR-184的丰度，导致繁殖力、生育力和生存力受损。这些发现强调了研究miRNA-靶标相互作用在生殖发育中的科学价值。

材料与方法

本研究以福建农林大学农林生物安全国家重点实验室饲养的瓜实蝇实验室品系为材料。通过转录组测序分析了雌虫卵巢、脂肪体、中肠和马氏管四种组织的基因表达谱，筛选出卵巢中特异性高表达的基因。利用生物信息学方法预测了候选基因的靶向miRNAs，并通过体内RNA免疫沉淀（RIP）、体外双荧光素酶报告基因检测以及定点突变技术验证了miRNA与靶基因的结合关系。通过RNA干扰（RNAi）敲低靶基因以及miRNA过表达，观察了对瓜实蝇雌虫产卵量、卵孵化率、卵巢形态等生殖表型的影响。所有实验均设置对照并进行统计学分析。

结果与分析

1. 转录组分析与候选基因鉴定

对卵巢、脂肪体、中肠和马氏管的转录组测序产生了高质量数据，主成分分析和相关性分析表明样本重复性好且组织间差异明显。通过差异表达基因分析，在卵巢中鉴定出三个相对于其他组织表达量极高（|log₂折叠变化| > 10）的基因，其中包含一个C型凝集素基因，将其命名为ZcCTL-S1。RT-qPCR验证了其表达模式与转录组数据一致。

2. ZcCTL-S1基因特征与系统发育分析

ZcCTL-S1的编码序列全长573 bp，编码190个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析预测其N端有信号肽，含有两个糖基化位点和33个磷酸化位点，并包含一个保守的CLECT结构域。系统发育分析将来自9种昆虫的CTLs分为三个明显的进化枝，瓜实蝇的ZcCTL-S1与实蝇科（Tephritidae）成员亲缘关系最近。

3. ZcCTL-S1基因的表达模式

ZcCTL-S1在新羽化的雌虫中即开始表达，呈现先上升后下降的趋势，在5日龄雌虫中表达量达到峰值。组织特异性表达分析显示，ZcCTL-S1主要在卵巢中高表达，其表达水平显著高于脂肪体、中肠和马氏管。荧光原位杂交（FISH）实验进一步证实，ZcCTL-S1的探针杂交信号主要定位在滋养细胞和卵母细胞中。

4. ZcCTL-S1敲低对生殖的影响

通过注射双链RNA（dsRNA）对ZcCTL-S1进行RNAi敲低，成功在注射后24、48和72小时显著降低了其mRNA水平，FISH信号也相应减弱。表型观察发现，敲低ZcCTL-S1并未显著影响雌虫的总产卵量、卵长度和卵巢面积，但导致为期三天的总孵化率显著降低。这表明ZcCTL-S1主要影响卵的孵化能力，而非产卵数量。

5. miRNAs预测及其在雌虫中的表达模式

结合miRanda和RNAhybrid算法，预测出三个可能靶向ZcCTL-S1的候选miRNA：miR-315-1、miR-971-1和miR-let-7。表达谱分析显示，miR-315-1和miR-971-1在7日龄雌虫中显著上调，而miR-let-7则在新羽化（1日龄）雌虫中表达量最高。在组织表达上，miR-315-1和miR-let-7在卵巢中表达显著升高，而miR-971-1在各组织间无显著差异。FISH实验显示miR-let-7在瓜实蝇卵巢的滋养细胞和卵母细胞中均有分布，与ZcCTL-S1的空间分布模式一致。

6. miRNAs对ZcCTL-S1基因表达的调控

过表达miR-971-1和miR-let-7能显著降低ZcCTL-S1的转录水平，而抑制它们则能上调ZcCTL-S1的表达。过表达或抑制miR-315-1对ZcCTL-S1的表达则无显著影响。这表明miR-971-1和miR-let-7可能负调控ZcCTL-S1。

7. miR-let-7与ZcCTL-S1的结合验证

RNA免疫沉淀（RIP）实验表明，用AGO-1抗体孵育细胞裂解液后，miR-let-7模拟物处理组中ZcCTL-S1mRNA的富集程度显著增加，而IgG抗体对照组无差异，证实了miR-let-7在体内与ZcCTL-S1的直接结合。

双荧光素酶报告基因实验进一步在体外验证了这种靶向关系。将包含预测结合位点的ZcCTL-S1野生型序列（WT）及其突变序列（MUT）构建到报告载体中。共转染实验显示，miR-let-7模拟物能特异性抑制WT报告载体的荧光素酶活性，而对结合位点突变的MUT载体则无此抑制作用。对于miR-971-1，其模拟物对WT和MUT报告载体的荧光素酶活性均无显著影响，排除了其与ZcCTL-S1的直接靶向关系。这些结果综合证实了miR-let-7通过其种子序列直接靶向ZcCTL-S1编码区的特定位点。

8. miR-let-7–ZcCTL-S1轴调控生殖

在验证了调控关系后，过表达miR-let-7以探究其生殖功能。结果显示，过表达miR-let-7并不影响雌虫的总产卵量、卵巢面积和卵长度，但导致了卵孵化率显著下降（降低21.33%）。这一表型与敲低ZcCTL-S1的结果高度一致，表明miR-let-7正是通过靶向抑制ZcCTL-S1的表达，从而负调控瓜实蝇的雌虫繁殖力。

讨论

本研究通过转录组学发现并验证了瓜实蝇卵巢特异性基因ZcCTL-S1。与以往研究主要关注CTLs的免疫功能不同，本研究发现敲低ZcCTL-S1主要损害卵孵化而非免疫防御，揭示了其在生殖中的关键作用。这丰富了我们对昆虫CTLs非免疫功能的认识。

研究进一步发现了上游调控因子miR-let-7，并通过多技术验证了其与ZcCTL-S1的直接靶向关系。miR-let-7在瓜实蝇卵巢高表达，其过表达能模拟敲低ZcCTL-S1的表型，显著降低孵化率。这表明在瓜实蝇中，miR-let-7通过抑制ZcCTL-S1的表达来调控雌性生殖。有趣的是，miR-let-7在不同昆虫中的表达模式和功能存在物种特异性，例如在飞蝗中过表达会损害卵巢发育，而在果蝇中则在卵巢低表达。这种差异凸显了在特定害虫中研究其特定调控网络的重要性。

结论

本研究在瓜实蝇中鉴定了一个新的miRNA-基因调控模块：miR-let-7靶向卵巢特异性C型凝集素基因ZcCTL-S1。该模块对于雌虫繁殖力至关重要，其破坏会显著降低卵孵化率。这一发现增进了我们对瓜实蝇雌性生殖功能转录调控机制的理解，并为开发基于基因或miRNA的害虫控制策略（如RNAi生物农药）提供了新的潜在靶点和理论依据。未来研究可进一步深入探索miR-let-7/ZcCTL-S1模块在瓜实蝇生殖调控与免疫功能之间的交叉对话。