《Insects》：MicroRNA Novel-m0027-3p Negatively Regulates Jhamt Gene and Affects Juvenile Hormone Biosynthesis in Apis mellifera Larvae
Ning Wang,
Si-Jia Deng,
Chuan-Lian Zhang,
Gen-Chao Gan,
Zi-Nuo Li,
Min Jiang,
Yi-Wen Liu,
Hao-Dong Zhao,
Jia-Run Yang and
Da-Fu Chen
+ 3 authors
编辑推荐：
本文鉴定出瓜实蝇卵巢特异性表达的C型凝集素基因ZcCTL-S1及其上游调控因子miR-let-7，并通过RNA免疫共沉淀、双荧光素酶报告系统及定点突变等技术，证实了miR-let-7与ZcCTL-S1的直接靶向关系。研究揭示，ZcCTL-S1的敲低或miR-let-7的过表达均能显著降低雌虫卵孵化率，从而损害其生殖力。该研究为深入理解miRNA-基因调控模块在昆虫生殖发育中的作用提供了新见解，并为开发基于基因或miRNA的害虫防治新策略提供了理论依据。
1. 引言
瓜实蝇是一种全球性的重要检疫性害虫，严重危害葫芦科和茄科作物。雌成虫产卵于果皮下，幼虫蛀食果肉，导致腐烂和减产。其幼虫的特殊取食习性和成虫的农药抗性降低了传统化学防治的效果。因此，开发针对性的、环境友好型治理策略，包括通过遗传手段抑制其生殖潜力，对于控制瓜实蝇种群增长至关重要。C型凝集素（CTLs）是动物凝集素家族中广泛分布的糖结合蛋白，在昆虫中传统上被认为是病原体识别和免疫防御的关键。然而，近期研究表明，CTLs在昆虫生殖的多个方面也扮演着角色。与此同时，微小RNA（miRNAs）作为内源性的基因表达转录后调节因子，在昆虫核心生殖过程中也起着重要作用。本研究旨在探究瓜实蝇雌虫生殖调控的分子机制，特别是由miRNAs介导的生殖过程，重点研究卵巢特异性CTL基因ZcCTL-S1及其可能的miRNA调控网络。
2. 材料与方法
研究使用实验室饲养的瓜实蝇品系。通过转录组测序，比较了卵巢、脂肪体、中肠和马氏管之间的差异表达基因，从中鉴定出卵巢特异性高表达的基因ZcCTL-S1。利用生物信息学方法预测了ZcCTL-S1的靶向miRNAs。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析了ZcCTL-S1及候选miRNAs在不同发育阶段和组织中的表达谱。利用RNA干扰（RNAi）技术敲低ZcCTL-S1，并观察其对雌虫生殖表型的影响。为了验证miRNA与ZcCTL-S1的靶向关系，综合运用了RNA免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因检测以及定点突变技术。此外，还通过荧光原位杂交（FISH）观察了ZcCTL-S1和miR-let-7在卵巢中的细胞定位。通过注射miRNA模拟物过表达miR-let-7，评估了其对雌虫生殖力的影响。所有数据均进行了统计分析。
3. 结果
3.1. 转录组分析及候选基因鉴定
转录组测序获得了高质量的测序数据，主成分分析和相关性分析表明样本重复性好且组织间差异明显。通过比较卵巢与其他组织，鉴定出大量差异表达基因。其中，基因ZcCTL-S1在卵巢中相对于其他组织呈现极高的上调表达（|log2FC| > 10），被确定为后续研究的候选基因。随机选择的基因经RT-qPCR验证，其表达模式与转录组分析结果一致。
3.2. ZcCTL-S1基因特征与系统发育分析
ZcCTL-S1的编码区全长573 bp，编码190个氨基酸。其蛋白N端具有信号肽，含有糖基化和磷酸化位点。保守结构域分析显示，包括ZcCTL-S1在内的多个昆虫CTL共享一个相同的CLECT结构域。系统发育树将CTL蛋白分为三个不同的分支，ZcCTL-S1与实蝇科的成员亲缘关系最近。
3.3. ZcCTL-S1基因表达模式
ZcCTL-S1在新羽化的雌成虫中即有表达，呈现先上升后下降的趋势，在5日龄雌成虫中表达量达到峰值。组织特异性表达分析显示，ZcCTL-S1主要在卵巢中高表达，其表达水平显著高于脂肪体、中肠和马氏管。FISH实验表明，ZcCTL-S1的特异性探针杂交信号主要定位于滋养细胞和卵母细胞。
3.4. ZcCTL-S1敲低对生殖的影响
注射dsCTL-S1可分别在24小时、48小时和72小时后显著降低ZcCTL-S1的mRNA水平。相应的，RNAi处理后，滋养细胞和卵母细胞中的荧光强度也显著减弱。敲低ZcCTL-S1后，卵巢形态、总产卵量、卵长度和卵巢面积均未发生显著变化。然而，ZcCTL-S1的敲低显著降低了三天内的总卵孵化率。
3.5. miRNAs预测及其在雌虫中的表达模式
结合miRanda和RNAhybrid两种算法，预测出三个可能与ZcCTL-S1结合的候选miRNA：miR-let-7、miR-315-1和miR-971-1。表达谱分析显示，miR-315-1和miR-971-1在7日龄雌成虫中显著上调，而miR-let-7在新羽化（1日龄）雌成虫中表达量最高。在组织表达上，miR-315-1和miR-let-7在卵巢中表达量显著更高，而miR-971-1在不同组织间无显著差异。FISH实验证实，miR-let-7在瓜实蝇的滋养细胞和卵母细胞中均有检测到，其空间分布模式与ZcCTL-S1一致。
3.6. miRNAs对ZcCTL-S1基因表达的调节
转染miRNA模拟物可成功上调三个候选miRNA的表达。然而，只有在转染miR-971-1和miR-let-7模拟物时，才观察到ZcCTL-S1表达的显著下降。相反，使用miRNA抑制剂下调miRNA表达时，只有抑制miR-971-1和miR-let-7能显著上调ZcCTL-S1的表达。这些结果表明，miR-971-1和miR-let-7可能负调控ZcCTL-S1。
3.7. miR-let-7与ZcCTL-S1的结合验证
RNA免疫共沉淀（RIP）实验表明，用AGO-1抗体孵育细胞裂解液后，miR-let-7模拟物处理组中ZcCTL-S1的富集显著增加，而IgG抗体处理组无显著差异，证实了miR-let-7直接靶向并介导ZcCTL-S1的转录后调控。双荧光素酶报告实验进一步验证了这种靶向关系：共转染pmirGLO-ZcCTL-S1-miR-let-7与miR-let-7模拟物会导致荧光素酶活性显著降低，而将预测的结合位点TATACAA突变后，这种抑制作用消失。对于miR-971-1，其预测结合位点的突变实验未显示显著的调控作用，排除了其与ZcCTL-S1的直接靶向关系。
3.8. miR-let-7-ZcCTL-S1轴调控生殖
在证实miR-let-7调控ZcCTL-S1的基础上，过表达miR-let-7以探究其生殖功能。与阴性对照组相比，过表达miR-let-7对总产卵量、卵巢面积和卵长度均无显著影响，但导致卵孵化率下降21.33%。这些表型结果与ZcCTL-S1的RNAi结果高度一致。
4. 讨论
本研究通过转录组分析成功鉴定了瓜实蝇卵巢特异性基因ZcCTL-S1。与CTL传统上主要参与免疫防御的认知不同，本研究发现ZcCTL-S1的敲低主要影响卵孵化率而非产卵量，表明其在瓜实蝇中主要参与生殖调控而非免疫防御，这丰富了人们对CTL非免疫功能的认识。通过生物信息学预测和实验验证，研究发现了上游调控miRNA miR-let-7。miR-let-7在瓜实蝇卵巢中高表达，并直接靶向ZcCTL-S1的编码区。过表达miR-let-7能产生与敲低ZcCTL-S1相似的表型，即显著降低卵孵化率。这表明miR-let-7通过负调控ZcCTL-S1来影响瓜实蝇的生殖力。miR-let-7在不同昆虫物种中的表达模式和功能存在差异，本研究明确了其在瓜实蝇生殖调控中的关键作用。
5. 结论
本研究在瓜实蝇中鉴定出一个新的调控模块，即miR-let-7靶向卵巢特异性基因ZcCTL-S1，该模块对雌虫的生殖力不可或缺。该研究增进了我们对这种害虫雌性生殖功能转录调控机制的理解，并为开发基于基因或miRNA的害虫防治策略提供了新的见解。未来的研究将重点探索miR-let-7/ZcCTL-S1模块介导的生殖调控与免疫功能之间的交叉对话。
