利用激光捕获显微切割技术和基于蛋白质固定化的毛细管微反应器实现快速、灵敏的空间蛋白质组学分析

《Analytica Chimica Acta》：Fast and Sensitive Spatial Proteomics Using Laser Capture Microdissection and a Protein Immobilization-Based Capillary Microreactor

高分辨率空间蛋白质组学分析：LCM-PICR工作流的开发与应用

　　

翁凌霄|张文佳|严国权|高明珠|张向民

复旦大学生物医学科学研究院化学系，上海200438，中国

摘要

背景

生物组织在空间上具有有序结构，包含具有不同局部功能的多种细胞群。空间蛋白质组学旨在测量蛋白质在其天然组织环境中的表达情况，但基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的工作流程的空间分辨率通常受到样品制备过程中损失的限制，这降低了对微小样本的检测灵敏度。

结果

在这项研究中，我们开发了一种基于蛋白质固定化的毛细管微反应器（PICR），并将其与激光捕获显微切割（LCM）技术结合，以实现高分辨率的空间蛋白质组学分析。值得注意的是，基于PICR的样品处理过程耗时不到1小时。利用LCM-PICR工作流程，我们从体积约为1.0 × 10^-5 mm³（厚度8 μm；半径约20 μm）的肿瘤组织微切区域中鉴定出了1700多种蛋白质。空间分析显示，有56种蛋白质在中心区域和外围区域之间的丰度存在显著差异。此外，20种蛋白质的丰度变化遵循采样区域的空间排列规律。几种与空间位置相关的蛋白质，包括NPM1、IMPDH2、CA9和PDK3，其特性与肿瘤外围和缺氧肿瘤核心的功能特征一致。

意义

LCM-PICR工作流程为基于LC-MS/MS的空间蛋白质组学分析提供了一种快速且灵敏的样品处理方法，适用于微米级组织区域。该方法有助于检测肿瘤内的空间结构化蛋白质变化，并为研究肿瘤内异质性和空间分辨的疾病生物学提供了实用工具。

引言

组织和器官由具有专门功能的空间有序子区域组成。这些细胞内的蛋白质表达反映了它们的生理状态和功能活性。[1]，[2]，[3] 因此，空间分辨的蛋白质组学分析对于理解组织结构和细胞异质性至关重要。[4]，[5] 基于抗体的成像方法具有高灵敏度和亚细胞分辨率，但其应用受到抗体可用性的限制，这限制了蛋白质组的覆盖范围，并阻碍了未知蛋白质的发现。[6]，[7]，[8]，[9]，[10] 质谱成像可以直接从组织切片中对生物分子进行无标记映射；然而，由于复杂的加合物形成、翻译后修饰以及离子化效率低下，可靠的蛋白质鉴定仍然具有挑战性。[11]，[12]，[13] 相比之下，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）能够提供全面且无偏的蛋白质组特征分析，已成为生物发现的核心工具。[14]

基于LC-MS/MS的空间蛋白质组学分析通常需要先分离具有相似物理特性的组织成分。[15]，[16]，[17] 然而，即使形态相似的区域也常常存在内在的细胞异质性，整体分析得到的信号可能是平均值，可能会掩盖特定区域的生物学特征。[18]，[19]，[20] 这一限制在肿瘤组织中尤为明显，因为小范围的空间区域内可能同时存在肿瘤细胞、正常细胞和免疫细胞。[21] 因此，需要高分辨率的空间蛋白质组学方法来从明确的组织结构中获取准确的分子信息。[22]

基于LC-MS/MS的蛋白质组学的空间分辨率主要受采样精度和样品制备效率的限制，尽管质谱技术本身具有极高的灵敏度。现有的采样策略包括手动切割、溶剂提取、原位液滴或水凝胶消化、激光捕获显微切割（LCM）等，其中LCM能够以接近单细胞分辨率精确分离组织区域，并已被广泛应用于空间蛋白质组学分析中。[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，[28]，[29] 然而，由于提取、清洗和消化过程中样品损失严重，为这种微小样本制备底向蛋白质组学分析仍然具有挑战性。[30] 为此，已经开发了几种微尺度样品制备方法，如SISPROT和HD-nanoPOTs，以提高基于LC-MS/MS的空间蛋白质组学分析的灵敏度。这些技术已使人们能够从面积小于0.1 mm²的样本中鉴定出1000多种蛋白质。[31]，[32] 单细胞深度视觉蛋白质组学（scDVP）技术可以从细胞切片中解析出1700种小鼠肝细胞的蛋白质空间组成。[33]，[34] 不过，这些方法需要专门的仪器或较长的处理时间，限制了其普遍适用性。

为了提高样品制备效率并实现高分辨率的空间蛋白质组学分析，我们开发了一种基于蛋白质固定化的毛细管微反应器（PICR），能够在纳升级别高效进行蛋白质组学处理。毛细管的内表面经过环氧基团修饰，可以共价固定蛋白质，从而实现原位提取、清洗和消化，同时最大限度地减少样品损失。在之前成功用于单细胞蛋白质组学分析的皮升级单细胞反应器（picoSCR）的基础上，我们进一步优化了PICR，使其适用于纳克级别的样品，并将其与LCM结合，建立了LCM-PICR工作流程，以实现高分辨率的空间蛋白质组学分析。[35] 在该工作流程中，每个微切样本可在1小时内被处理成肽段，从而缩短了显微切割与LC-MS/MS分析之间的时间间隔。利用这一流程，我们从体积为1.0 × 10^-5 mm³的小鼠乳腺肿瘤组织区域中鉴定出了1700多种蛋白质，其中56种蛋白质在中心区域和外围区域之间的丰度存在差异。空间梯度分析显示，20种蛋白质的丰度变化与采样区域的空间排列相关。总体而言，这些结果表明，LCM-PICR工作流程能够实现对微米级组织区域的高灵敏度、可重复性和空间分辨的蛋白质组学分析，能够捕捉到蛋白质表达中的生物学意义上的空间异质性。

部分内容摘录

细胞培养

所有细胞均在直径6厘米的培养皿中，在37°C和5% CO₂条件下培养。HeLa细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中生长。4T1细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中生长。当细胞达到80%汇合度时进行收获，然后用PBS溶液洗涤三次。

LCM-PICR蛋白质组学样品处理工作流程的设计

为了提高LC-MS/MS分析的样品制备灵敏度并实现高分辨率的空间蛋白质组学分析，我们开发了一种基于蛋白质固定化的毛细管微反应器（PICR），并将其与LCM结合，建立了LCM-PICR工作流程。该流程旨在处理来自微米级组织区域的纳克级别蛋白质样本，以进行底向蛋白质组学分析。如图1所示，冷冻肿瘤组织切片被固定在聚萘酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片上。

结论

在这项研究中，我们开发了一种LCM-PICR空间蛋白质组学工作流程，能够实现对微米级组织区域的高分辨率蛋白质组学分析。基于蛋白质固定化的策略以及PICR反应器中的纳升级别处理减少了样品损失，提高了蛋白质组学样品制备的灵敏度。每个样品的总处理时间不到1小时。从厚度为8 μm、半径约为20 μm的肿瘤区域中，我们鉴定出了1700多种蛋白质。

CRediT作者贡献声明

张向民：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、方法学设计、资金获取。翁凌霄：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学设计、实验实施。张文佳：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验实施。严国权：方法学设计。高明珠：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、方法学设计、资金获取、概念构思

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

伦理声明

本研究中使用的所有肿瘤组织均符合伦理标准。该研究已获得复旦大学审查委员会和伦理委员会的批准。

数据可用性声明

质谱蛋白质组学数据已通过iProX合作伙伴存储库上传至ProteomeXchange联盟（https://proteomecentral.proteomexchange.org），数据集标识符为PXD056747。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号22574027）和国家重点研发计划（编号2024YFC3405401）的支持。