《Analytical Biochemistry》：Measurement of the absolute mass concentration of antigen-specific serum IgG via quantitative Western blotting
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Ag-specific抗体定量检测存在传统ELISA因洗步导致低亲和力抗体检测不足的问题。本研究提出磁性微球结合无洗步定量西 blotting新方法，通过Ag固定磁性微球直接捕获血清抗体，利用已知浓度的IgG标准品进行绝对浓度测定，无需考虑抗体亲和力差异。实验证明该方法能更准确反映总Ag-specific IgG浓度，且与ELISA结果存在显著差异，验证了ELISA受参考抗体亲和力影响和洗步导致假阴性结果。该方法为标准化免疫应答评估提供新工具。
亚历山大·R·迈耶 | 李丽波 | 程伟
密歇根大学药学科学系，教堂街428号，安娜堡，密歇根州48109，美国
摘要
定量抗原特异性抗体（Ag-specific Abs）对于评估接种疫苗或感染后的免疫反应至关重要。传统的ELISA检测结果可能受到抗体亲和力和参考标准选择的影响，因为该检测过程涉及大量的洗涤步骤。我们提出了一种不依赖抗体亲和力的方法，通过基于磁珠的Ag捕获技术结合定量Western blotting来测定动物血清中Ag特异性IgG的绝对质量浓度，且无需任何洗涤步骤。首先，该技术的自洽性使我们能够确定已知浓度的纯化单克隆抗体的结合活性；其次，这种方法能够几乎完全捕获动物血清中的Ag特异性IgG，并且背景干扰极低，Western blotting定量结果具有良好的重复性。我们使用针对不同蛋白质抗原产生的小鼠血清来演示这种方法，并将其结果与ELISA结果进行直接比较，发现ELISA的测量结果会随参考抗体的不同而变化。在同一样本中，我们同时定量了总IgG和Ag特异性IgG，观察到免疫后Ag特异性IgG的比例逐渐增加。我们的方法得到的浓度通常高于ELISA的结果，这表明存在ELISA难以检测到的低亲和力IgG群体。这种无需校准、不受抗体亲和力影响的测量方法能够实现跨研究的准确和标准化Ag特异性IgG定量，从而有效评估免疫反应。
引言
疫苗的发明对公共卫生产生了巨大影响，显著降低了麻疹、脊髓灰质炎和百日咳等儿童疾病的发病率和死亡率。[1] 由于抗原特异性抗体（Ag-specific Abs）具有直接中和病原体和通过Fc介导的效应功能的双重作用，它们被确定为许多疫苗保护作用的主要指标。[2, 3, 4, 5, 6] 因此，经常通过测量Ag特异性Ab的滴度（包括ELISA结合滴度[7]、病毒中和滴度[8]和血凝抑制滴度[9]）来预测疫苗的有效性。
然而，滴度仅表示抗体的相对浓度——即仍能保持一定生物活性的抗体稀释程度。由于滴度受所有影响活性测定的因素的影响，不同检测方法或实验室之间的滴度比较较为困难。一个简单的替代方法是直接测定Ag特异性Ab的浓度。为此，传统的ELISA依赖于使用已知浓度的参考抗体来定量血清中的Ag特异性IgG。[10] 但通常假设参考抗体的亲和力与研究中的抗体处于相似范围，但实际上这一假设难以验证。[10, 11, 12] 因此，ELISA的一个重要局限性是其实验结果受到抗体对其抗原亲和力的显著影响，这一点已被广泛研究。[10, 13, 14, 15, 16] 事实上，早期研究显示，ELISA对低亲和力和高亲和力抗体的检测灵敏度可能相差高达10^5倍。[17] 此外，由于常规ELISA协议涉及大量洗涤步骤，因此ELISA并非真正的平衡测定。在洗涤过程中，结合速率较快的抗体可能会从平板上解离，因此最终读数主要反映的是那些结合较慢的抗体。
因此，如果使用ELISA来定量Ag特异性Ab的浓度，必须假设研究中的抗体与其相应抗原的结合亲和力与参考抗体相似。在主动免疫反应中，抗体在生发中心经历亲和力成熟，此时这一假设不再成立，因为抗体的亲和力会随时间变化。[18] 缺乏合适的参考标准不仅限制了测量的准确性，也使得结果难以标准化进行比较。因此，需要一种可靠的方法来以绝对单位（如mg/mL）直接测量血清中Ag特异性Ab的真实浓度，而无需依赖对抗体与其抗原亲和力的了解。
为此，我们开发了一种方法，利用表面涂有抗原的磁珠，在不进行任何洗涤步骤的情况下从血清样本中富集和分离Ag特异性Ab。然后通过与不需要与样本抗体亲和力匹配的IgG质量参考物进行定量Western blotting，来确定Ag特异性Ab的绝对质量浓度。我们证明该方法能够高效且准确地捕获和定量生理相关浓度的IgG。重要的是，该方法可以同时测量结合态和游离态的抗体，并且可以通过质量平衡轻松验证所有抗体是否在检测过程中被完全回收。对于纯化的抗体样本，结合态和游离态抗体的准确浓度有助于确定纯化抗体的实际结合活性，即能够主动结合目标抗原的抗体部分。已知只有部分纯化抗体样本能够主动结合其目标抗原，[19, 20, 21, 22, 23] 因为常见的抗体纯化过程或翻译后修饰可能导致抗体结合活性丧失。[24, 25, 26, 27, 28, 29] 该技术还可以在一次检测中同时量化动物血清中Ag特异性IgG占总IgG的比例。
实验部分片段
SVLS的合成
所有用于小鼠免疫的合成病毒样结构（SVLS）均按照我们之前发表的协议制备。[30, 31, 32] 这些SVLS由非免疫原性脂质（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺（聚乙二醇）-2000]（铵盐）组成，它们排列成单层脂质体，在脂质体表面以可控的方向和表位密度展示蛋白质抗原（ED）。
ELISA检测结果因参考抗体的不同而变化
为了进行比较，我们首先根据ELISA中的mAb参考值测量了免疫后小鼠血清中RBD特异性IgG的浓度。由于事先不知道RBD特异性IgG的亲和力，我们使用了三种市售的小鼠抗RBD mAb：mAb1（黑色圆圈）、mAb2（红色方块）和mAb3（绿色菱形）。这些mAb在几个关键参数上存在差异：
讨论
尽管ELISA常被视为生物样本中Ag特异性Ab定量的金标准，但传统ELISA方法存在重要局限性。由于检测过程中涉及大量洗涤步骤，ELISA无法提供Ag特异性IgG的真实浓度；此外，其检测结果取决于所研究抗体的浓度、表观结合活性和亲和力，且难以区分这两种因素。
CRediT作者贡献声明
亚历山大·R·迈耶：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验设计。
李丽波：实验设计、审稿与编辑、数据可视化、项目监督、资金获取、概念构思。
未引用的参考文献
[59.; 60.; 61.; 62.]
机构审查委员会声明
动物实验方案已获得密歇根动物护理和使用委员会（协议代码PRO00011499）的批准。使用动物样本也得到了密歇根大学机构生物安全委员会（协议编号IBCA00001110_AR04）的批准。
数据可用性
所有数据均包含在文章中。如有其他问题或需求，请联系相应作者。
财务支持
本工作得到了NIH/NIAID资助（项目编号1R01AI155653-01A1，资助者WC）。ARM部分得到了NIH/NIGMS细胞生物技术培训计划（项目编号GM145304）的支持，以及美国药物教育基金会的博士后奖学金和密歇根大学Rackham博士后奖学金的支持。
利益冲突声明
WC拥有SVLS的相关专利。其他利益冲突情况未予披露。
致谢
我们感谢Pete Tessier博士允许我们使用他们的Western blotting设备。同时感谢Cheng实验室的成员，特别是Sekou-Tidiane Yoda和Erika Kay-Tsumagari对手稿的仔细审阅。
