斑马鱼（Danio rerio）母体接触邻苯二甲酸二乙酯（DEP）和二甲基亚砜（DMSO）的跨代影响

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《Aquatic Toxicology》：Transgenerational effects of maternal exposure to diethyl phthalate (DEP) and dimethyl sulfoxide (DMSO) in zebrafish ( Danio rerio)

【字体：大中小】 时间：2026年03月07日 来源：Aquatic Toxicology 4.3

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　　DEP和DMSO对斑马鱼跨代生殖及软骨发育的影响研究，通过RNA测序发现DEP在F2代引起软骨发育异常，且DMSO可能通过调控Cyp19a1a基因表达和表观遗传修饰产生干扰作用。

黄志俊|邱玲|庄欣茹|吴素梅

台湾国立嘉义大学水生生物科学系

摘要

邻苯二甲酸二乙酯（DEP）是一种已知的干扰颅面软骨生成的物质，而二甲基亚砜（DMSO）被广泛用作溶剂。然而，DMSO与DEP在毒理学实验中是否存在相互作用仍需进一步研究。本研究调查了暴露于含DEP水（空白组）、DMSO（对照组）或DMSO溶解DEP中的水（处理组）的雌性鱼类（F0代）的跨代影响，并利用RNA-seq技术分析了F0代卵巢以及F1代和F2代受精后24小时（hpf）胚胎的转录变化。在卵巢中，与对照组相比，DMSO处理组中Cyp19a1a的mRNA表达上调，而DEP处理组则下调，这可能与Cyp19a1a启动子的甲基化水平改变有关。DEP或DMSO均导致F2代早期幼鱼的颅面软骨发育异常。在卵子成熟过程中，DEP暴露显著干扰了卵泡激活和卵黄蛋白生成过程。基因本体论（GO）富集分析和差异表达基因（DEGs）的数量显示，F2代受到的影响比F1代更严重。这些结果表明DEP可能调节而非加剧DMSO引起的变化，提示在实验设计中不应忽视DMSO的影响。

引言

内分泌干扰物（EDCs）是一类会破坏对发育、稳态和生殖过程至关重要的激素通路的物质。多项研究表明，EDCs可通过摄入进入人体，尤其是通过水产品，可能干扰免疫功能、引发神经退行性疾病、损害新陈代谢并促进物质转移（Prata等人，2020年）。EDCs的污染来源包括工业制造、药品加工、污水处理厂和人类废物，这些都会导致水环境受到污染（Barse等人，2007年）。邻苯二甲酸二乙酯（DEP）因其对生殖的负面影响而被列为高度关注的化学物质。

在台湾，被归类为EDCs的邻苯二甲酸酯（PAEs）中，对邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的毒性研究受到了广泛关注，因为其污染程度最高，通常报告为第二大污染物（Wang等人，2022年）。DEP和DEHP均不易生物降解，并且是邻苯二甲酸降解途径中的17种中间体之一（Feng等人，2021年）。值得注意的是，DEP的生物累积系数高于DEHP（Mankidy等人，2013年），至今台湾环境保护署（TEPA）尚未正式将其认定为EDC。我们之前的研究表明，8.06 μM的DEP暴露会干扰雌性斑马鱼体内的17β-雌二醇（E2）水平，降低Esr2b和Plcg1的表达，并改变F1代后代的角软骨（CH）角度（Tseng等人，2023年）。因此，DEP的毒性风险可能被低估了，需要进一步研究。

据报道，DEP的96h-LC50值在鲤鱼（Cyprinus carpio）中为48 mg/L（Barse等人，2007年），在罗非鱼中为50 mg/L（Sepperumal和Saminathan，2013年）。相比之下，自然水环境中的DEP浓度相对较低（0.003-20 μg/L）（Prevari?等人，2021年），台湾西部废水污泥样本中的浓度范围为0.75-33.3 μg/kg干重（d.w.）（Wang等人，2022年）。然而，在台湾北部的河口鱼类中检测到了DEP，浓度高达130.2 μg/kg干重（Lu等人，2021年）。目前没有证据表明DEP对台湾的人类健康构成威胁。不过，Zhang等人（2015年）报告称在中国的长江-江苏段，DEP具有显著的风险指标（风险商数/RQ 175）。此外，我们之前的研究显示，母体暴露于8.06 μM（1.79 mg/L）的DEP持续5天会影响斑马鱼F1代后代的角软骨发育并降低其游泳能力（Tseng等人，2021年；Wu等人，2022年）。初步研究还发现F2代幼鱼的颅面软骨发育也出现异常。尽管这种暴露剂量几乎是中国地表水环境质量标准（PRC-NS，2002年）的6倍，但这些发现表明DEP暴露对脊椎动物的影响具有跨代性，同时也强调了在实验设计中不应忽视DMSO的影响。

EDCs不仅会影响直接暴露的亲代，还会影响从未接触过这些化学物质的后续世代（Bhandari等人，2015年）。除了EDCs的潜在毒性外，它们对亲代（F0代）的直接影响还可能波及未暴露的F1代或F2代，这分别属于多代效应和跨代效应（DeCourten等人，2020年）。基于我们之前关于DEP对F0代和F1代影响以及F2代角软骨发育的研究，我们想了解DEP是否具有跨代效应。本研究旨在进一步验证DEP对F2代幼鱼的破坏作用，并比较F0代雌性卵巢与其F1代和F2代胚胎的基因表达谱和生殖能力。

二甲基亚砜（DMSO）或乙醇是溶解邻苯二甲酸酯毒理学测试中常用溶剂。先前的研究建议，斑马鱼胚胎培养基中的DMSO浓度不应超过100 μL/L（0.01%）（Hoyberghs等人，2021年）。在DMSO浓度低于0.04%的情况下，斑马鱼孵化过程未受延迟（Hallare等人，2004年），且暴露于1% DMSO的斑马鱼幼鱼在受精后120小时内未出现致死或明显形态畸形（Hoyberghs等人，2021年）。另一项研究将DMSO对发育毒性和应激蛋白分析的无观察效应浓度（NOEC）定义为小鱼1%，斑马鱼0.001%（Xiong等人，2017年）。这些研究表明，毒理学研究中使用的DMSO浓度需要谨慎控制。即使低浓度也可能影响发育结果或与测试化学物质相互作用，从而干扰毒性评估。另一方面，0.8% v/v乙醇在45小时内的有效水溶性浓度会导致50%的斑马鱼胚胎出现畸形（Reimers等人，2004年）。因此，在我们的研究中，通常使用0.1% DMSO作为溶剂，而非酒精，我们发现暴露于0.1% DMSO中的斑马鱼胚胎与对照组（0.1% DMSO）相比表现出异常发育（Tseng等人，2021年）。然而，目前尚不清楚DMSO是否对斑马鱼的发育有独立影响，或者它是否与邻苯二甲酸酯有协同作用。

目前对EDCs跨代效应的理解有限。例如，DEHP暴露会影响水蚤（Daphnia magna）从F0代到F2代的存活率、繁殖能力和体长，尽管其潜在机制尚未完全阐明（Le等人，2019年）。已在蠕虫、果蝇、植物、小鼠和少数鱼类物种中报道了表型改变的表观遗传跨代遗传（Champagne，2008年；Bhandari等人，2015年）。在青鳉和斑马鱼中，双酚A（BPA）和17α-乙炔雌二醇（EE2）的暴露并未在F0代和F1代引起明显的表型异常，但在F2代后代观察到受精率显著降低，F3代后代胚胎存活率下降（Bhandari等人，2015年）。这些结果表明，跨代效应可能是通过DNA甲基化、组蛋白修饰或miRNA通过ER信号通路等独特的表观遗传机制介导的（Bhandari等人，2015年）。已知睾酮转化为E2的过程受卵巢芳香化酶基因Cyp19a1a的调控。在大口黑鲈（Micropterus salmoides）中，Cyp19a1a的表达在孵化后20天开始（Du等人，2021年），进一步证明了其在E2合成中的关键作用。因此，我们假设DEP暴露可能抑制Cyp19a1a的表达，从而导致E2水平下降、雌激素受体（ERs）表达改变和角软骨发育异常。因此，在本研究中，我们分析了Cyp19a1a的表达和启动子甲基化，因为它在调控E2合成和雌激素受体活性中起重要作用。

鉴于DEP和DMSO的潜在跨代效应，以及雌激素生物合成基因和表观遗传调控的参与，全面的转录组分析对于阐明其潜在机制至关重要。RNA-seq技术可以捕获特定细胞、组织或生物体中的所有转录本，实现样本间基因表达变化的量化及相关基因的功能注释（Qian等人，2014年）。在本研究中，我们对F0代雌性卵巢以及F1代和F2代幼鱼的转录组样本进行了RNA-seq分析，以验证我们的假设并识别与颅面发育、卵巢合成和DNA甲基化相关的基因。

鱼类伦理和培养基制备

共60条成熟的斑马鱼（Danio rerio，性别比1:1）被饲养在三个40升的养殖箱中，养殖箱内循环使用去氯自来水，水温为28.5°C，光照/黑暗周期为14:10。每天喂食两次卤虫（Ocean Star International, Inc.，美国犹他州）和商业饲料（Taikong Corp.，新北市，台湾）。所有实验程序均遵循行政院发布的《实验动物护理和使用指南》。