《Microbiology Spectrum》：Metagenomic analysis of gut bacteria in different developmental instars of Spodoptera litura
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本综述通过宏基因组测序，系统揭示了斜纹夜蛾（S. litura）从卵到成虫各发育阶段肠道细菌的群落结构动态与功能特征。研究阐明了肠道菌群在宿主消化（碳水化合物活性酶CAZymes）、解毒（细胞色素P450、谷胱甘肽S-转移酶GST、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶UGT等酶系）和代谢通路（KEGG）中的关键作用，为理解昆虫-微生物互作及开发基于肠道微生物的新型害虫防控策略提供了重要见解。
斜纹夜蛾肠道菌群跨发育龄期的宏基因组学分析
INTRODUCTION
斜纹夜蛾（Spodoptera litura）是一种在全球范围内广泛分布的多食性重大农业害虫，可危害包括棉花、豆类、烟草和蔬菜在内的多种作物，常导致间歇性爆发，造成严重农业损失。当前其治理主要依赖化学杀虫剂，但长期使用加剧了害虫的抗药性，并带来严重的食品与环境安全问题。昆虫肠道系统是摄食、消化和排泄的关键场所，其动态多变的环境为共生微生物提供了独特的定殖生态位。这些肠道微生物拥有多样的酶系统，能够协助宿主合成维生素、吸收脂肪与碳水化合物，并参与解毒和增强杀虫剂抗性。例如，鳞翅目害虫棉铃虫（Helicoverpa armigera）的肠道细菌如肠球菌（Enterococcus）和肠杆菌（Enterobacter）已被证明可介导宿主植物毒素的降解。同样，草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）的肠道菌群可通过共生酶灭活毒死蜱，直接贡献于宿主的农药抗性。因此，肠道微生物群已成为开发新型害虫控制策略的一个有前景的基础。通过操纵肠道菌群组成、破坏共生微生物平衡，可以实现环境友好的生物防治方法。目前，利用宏基因组学技术分析复杂微生物群落，为解析昆虫肠道细菌的组成、多样性和功能基因表达提供了强大平台。本研究旨在通过宏基因组分析，阐明斜纹夜蛾不同发育阶段肠道细菌的组成、多样性和功能基因表达，以揭示发育变化对肠道微生物群落的影响，并探索肠道微生物在斜纹夜蛾生长发育中的潜在作用。
MATERIALS AND METHODS
斜纹夜蛾幼虫采集自中国贵州省福泉市的烟草田，随后在人工气候室（温度26°C ± 1°C，相对湿度70% ± 5%，光暗周期14:10小时）内用人工饲料饲养。成虫饲喂10%蜂蜜溶液作为营养补充。分别收集卵（E）、一至六龄幼虫（L1–L6）、蛹（P）和成虫（A）的肠道样本用于宏基因组分析。解剖前对幼虫进行饥饿处理以减少食物残渣和粪便污染，并进行表面消毒。样本经液氮速冻后于-80°C保存。测序工作由诺禾致源生物信息科技有限公司完成。原始测序数据经过严格的质量控制处理，包括去除低质量读段、含未知碱基（N）过多的读段、接头序列，并通过比对斜纹夜蛾参考基因组过滤宿主来源序列。使用MEGAHIT软件组装得到干净数据的scaftigs。利用MetaGeneMark预测开放阅读框（ORF），并使用cd-hit软件去冗余，生成非冗余基因目录（Unigenes）。通过Bowtie2将各样本的干净数据比对至初始基因目录以量化基因丰度。使用DIAMOND软件将Unigenes比对至NCBI NR数据库进行物种注释，并应用最低共同祖先（LCA）算法分配物种注释。将Unigenes比对至功能数据库（京都基因与基因组百科全书KEGG和碳水化合物活性酶CAZy数据库）进行功能注释。通过实时定量PCR（RT-qPCR）分析了两个解毒基因在肠道样本中的表达，以EFα1为内参基因。实验数据使用Excel 2010和GraphPad Prism 8处理，采用2-ΔCt方法计算基因相对表达量，并使用SPSS 22.0软件进行Tukey检验（P < 0.05）。
RESULTS
Quality and assessment of gut data
从斜纹夜蛾不同发育阶段样本获得的原始测序数据量在19.07 Gb至20.74 Gb之间。预处理后得到的高质量干净数据量在18.86 Gb至20.34 Gb之间，占原始数据的比例均超过97%。Q20碱基百分比均高于96.64%，Q30碱基百分比均高于90.72%，GC含量在36.60%至41.93%之间，表明测序数据准确可靠。组装后获得的Scaftigs总长度在1.13×109bp至1.23×109bp之间。从组装的contigs中共预测出266,054个ORF。非冗余基因目录的平均长度为331.91 bp，平均GC含量为45.27%。
Metagenomic sequencing analysis of gut microbiota
宏基因组分析显示，在斜纹夜蛾卵、各龄期幼虫、蛹和成虫的肠道样本中，细菌分别占总肠道微生物的17%至43%。古菌、病毒和真核生物占比较低，均低于3%。在所有样本中，共鉴定出75个门、125个纲、242个目、462个科、832个属和1700个物种的微生物。在所有发育阶段，最丰富的门是假单胞菌门（Pseudomonadota），其次是疣微菌门（Verrucomicrobiota）。在一、二和三龄幼虫阶段，第二丰富的门是芽孢杆菌门（Bacillota）。其余排名前十的门还包括拟杆菌门（Bacteroidota）、毛霉门（Mucoromycota）等。在属水平上，斜纹夜蛾发育阶段中最丰富的三个属存在差异。在卵、一龄幼虫、蛹和成虫阶段，前三位是假单胞菌属（Pseudomonas）、鱼立克次体属（Piscirickettsia）和不动杆菌属（Acinetobacter）。在二、三、四和五龄幼虫阶段，前三位是假单胞菌属、肠球菌属（Enterococcus）和不动杆菌属。在六龄幼虫阶段，前三位是假单胞菌属、鱼立克次体属和肠杆菌属（Enterobacter）。其余排名前十的属还包括阿克曼菌属（Akkermansia）、肾丝菌属（Nephrothrix）等。
Functional annotation of the gut microbiota metagenome of S. litura
通过CAZy数据库进行功能注释发现，在斜纹夜蛾不同发育阶段的肠道中，鉴定出的最丰富的碳水化合物活性酶（CAZyme）基因是糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs），其次是碳水化合物结合模块（CBMs）、辅助活性酶（AAs）、碳水化合物酯酶（CEs）和多糖裂解酶（PLs）。其中，卵、蛹和成虫阶段注释到的CAZyme基因相对较少，而一龄和二龄幼虫阶段注释到的基因数量较多。通过KEGG数据库比对，注释到六大生物代谢通路的基因数量分别为：细胞过程3,743个、环境信息处理5,372个、遗传信息处理3,519个、人类疾病4,517个、代谢9,735个、生物体系统3,360个。基于丰度信息的聚类热图分析显示，不同发育阶段的KEGG通路丰度模式存在差异。在卵期，主要注释通路是心血管疾病、环境适应等。在一龄和二龄幼虫、蛹和成虫期，主要通路是细胞生长与死亡、运输与分解代谢等。在三龄幼虫期，主要通路是复制与修复、翻译、辅因子和维生素代谢等。在四、五、六龄幼虫期，主要通路是信号转导、细胞运动、衰老、辅因子和维生素代谢以及抗菌药物耐药性。在代谢通路中，各发育阶段注释到的基因数量从高到低依次为：二龄、一龄、三龄、四龄、五龄、六龄幼虫、成虫、蛹和卵。在幼虫早期，斜纹夜蛾需要大量的代谢活动来支持生长发育。随着发育阶段的推进，代谢活动下降。在成虫、蛹和卵阶段，取食很少或没有，代谢活动最低。在异生素生物降解和代谢这一代谢子通路中，共注释到19个子功能，其中注释最多的通路是“药物代谢-其他酶”、“细胞色素P450介导的异生素代谢”和“药物代谢-细胞色素P450”。进一步分析发现，这些通路涉及多种酶基因。在“药物代谢-其他酶”通路中，注释到22个酶基因，主要包括黄嘌呤脱氢酶（XDH）、核苷二磷酸激酶（NDK）和尿苷-胞苷激酶（UCK）。在“细胞色素P450介导的异生素代谢”通路中鉴定到的酶是羰基还原酶1（CBR1），而在“药物代谢-细胞色素P450”通路中鉴定到的酶是aofH。这些通路共有的酶包括醇脱氢酶5（ADH5）和frmA。三个通路共同拥有的酶是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶（UGT）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）。宏基因组分析还识别了这些关键解毒酶的潜在微生物来源。XDH主要由γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）编码，NDK和UCK由肠球菌属（Enterococcus）编码。ADH5和frmA由肠球菌属编码。此外，adhP主要由肠杆菌属（Enterobacter）和肠球菌属编码，GST由假单胞菌属、肠杆菌属和大肠杆菌属（Escherichia）共同编码，UGT由大肠杆菌属编码。这些酶基因在斜纹夜蛾的发育阶段表现出显著的表达差异。UGT、GST、XDH、NDK和CBR1主要在成虫期表达，而adhP主要在一、二、三龄幼虫期表达。UCK和ADH5主要在一龄和二龄幼虫期表达。
RT-qPCR analysis of detoxification enzyme genes
选择了四个解毒酶基因进行RT-qPCR分析。结果显示，同一酶家族内的不同基因在肠道不同发育阶段表现出相似的表达趋势。与宏基因组绝对丰度模式比较时，GST基因表现出不一致的趋势，而UGT基因则与宏基因组数据基本一致。
DISCUSSION
本研究通过宏基因组分析揭示了斜纹夜蛾肠道微生物群落在不同发育阶段的动态特征。昆虫的肠道微生物也受宿主发育阶段的影响。本研究发现斜纹夜蛾不同发育阶段的优势肠道细菌群落存在差异：门水平多样性分析显示，假单胞菌门在所有阶段广泛分布，芽孢杆菌门在低龄幼虫阶段占主导，而疣微菌门在高龄幼虫、卵、蛹和成虫阶段的丰度显著增加。在细菌属注释结果中，斜纹夜蛾的肠道细菌群落主要由假单胞菌属组成，肠球菌属在幼虫中占优势，而鱼立克次体属在卵、蛹和成虫阶段占优势。同样，本研究也发现假单胞菌属、肠球菌属和肠杆菌属是斜纹夜蛾肠道的优势属，并广泛存在于各发育阶段的肠道微生物群落中。但也有一些差异，部分先前报道的斜纹夜蛾优势肠道菌在本研究中未检测到，这可能源于斜纹夜蛾生活环境、食物类型、发育阶段和研究方法的差异。利用CAZy数据库，我们鉴定出一系列碳水化合物活性酶（CAZymes），发现糖苷水解酶（GHs）和糖基转移酶（GTs）基因在斜纹夜蛾所有发育阶段的肠道中高表达，其次是碳水化合物结合模块（CBMs）、辅助活性酶（AAs）、碳水化合物酯酶（CEs）和多糖裂解酶（PLs）基因。其中，一龄和二龄幼虫阶段注释到的CAZyme基因较多，而卵、蛹和成虫阶段注释到的基因较少。CAZymes主要负责昆虫肠道中碳水化合物的消化，将复杂碳水化合物分解为简单糖类以供昆虫吸收利用。作为一种植食性昆虫，斜纹夜蛾肠道中也含有大量的CAZymes，且在幼虫期含量丰富。由于斜纹夜蛾主要在幼虫期取食，其肠道中的CAZymes在分解碳水化合物和消化食物方面发挥作用，其中GH和GT是关键酶类。在生存过程中，昆虫面临各种异生素，包括植物次生代谢物、杀虫剂和其他环境毒素。为了适应这些化学胁迫，昆虫进化出了复杂的生物降解和代谢途径：异生素生物降解和代谢途径。我们的研究发现，在斜纹夜蛾肠道的异生素生物降解和代谢途径下的19个子通路中，注释最多的通路是“药物代谢-其他酶”、“细胞色素P450介导的异生素代谢”和“药物代谢-细胞色素P450”，这些均与药物抗性相关。此外，我们还鉴定了参与这些通路的不同酶类。“药物
