草鱼trpc3基因功能鉴定：揭示其在盐胁迫下渗透调节中的关键作用及其调控机制

本研究首次揭示草鱼trpc3基因在盐胁迫渗透调节中的核心作用。通过RNA干扰(RNAi)敲低实验，证实该基因通过介导Ca2+内流，调控鳃和肾脏中NKA、CaN、Ca2+-ATPase等关键酶活性及相关离子转运基因表达，从而驱动机体恢复渗透稳态，为培育耐盐草鱼新品系提供了新理论依据。

　　

1. 引言

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国最重要的淡水养殖鱼类，2023年全国产量达590.48万吨。然而，在拥有大面积盐碱水体的西北地区，高盐环境严重制约了其养殖产量。开发盐碱水域、培育耐盐品种是拓展水产养殖空间、促进行业发展的重要途径。研究表明，草鱼具有一定的耐盐性，且在咸水中养殖可改善肌肉品质，是盐碱水养殖的潜在候选物种。

盐度是影响水生生物生理过程的主要非生物因子，主要通过破坏渗透压和离子平衡来影响鱼类。鱼类的渗透调节是一个依赖离子通道和转运蛋白的耗能过程，主要在鳃、肾脏等器官中进行。钙离子(Ca²⁺)作为普遍的第二信使，在感知环境胁迫和启动细胞内信号级联反应中起着关键作用。瞬时受体电位阳离子通道亚家族C成员3(TRPC3)是一种对Na⁺和Ca²⁺具有通透性的非选择性阳离子通道，参与细胞对外部刺激的响应。在鱼类中，trpc3可能同样介导盐胁迫下的Ca²⁺信号传导，从而调控下游的离子转运。然而，其在草鱼盐胁迫过程中的具体作用，包括对上下游基因表达及相关生理过程的影响，尚不清楚。

RNA干扰(RNAi)是一种通过小RNA介导的真核生物基因调控机制。本研究旨在阐明trpc3在草鱼盐胁迫渗透调节中的作用。通过qRT-PCR分析其在不同盐度下鳃和肾组织中的表达，并首次通过RNAi进行该基因的功能缺失研究，探究其对渗透调节基因表达、血清渗透压、离子浓度以及鳃和肾中关键酶活性的影响。结果首次在鱼类中证实了TRPC3介导的Ca²⁺信号与离子转运酶下游调控级联之间的功能联系，为理解鱼类盐度适应和培育耐盐草鱼品种奠定了新的理论基础。

2. 材料与方法

2.1. Trpc3序列分析

从NCBI数据库获取草鱼trpc3 (XM_051861043.1) cDNA序列。使用在线工具分析蛋白质理化性质、亚细胞定位、跨膜螺旋数量和保守结构域。通过多序列比对和系统发育树分析其进化关系。

2.2. 合成trpc3-dsRNA

利用在线工具设计trpc3-dsRNA的沉默靶点，并设计带有T7启动子序列的引物。以鳃cDNA为模板进行PCR扩增，产物纯化后作为模板进行体外转录，合成并纯化trpc3-dsRNA。

2.3. 草鱼日常管理

实验用草鱼购自广东省肇庆市。实验前挑选大小相近的草鱼在充气水中驯化7天。使用海水盐配制4、7、10 ppt的盐水。

2.4. 实验设计与样品采集

设置了不同盐度胁迫实验、trpc3-dsRNA干扰效率检测实验以及在急性盐胁迫下的trpc3-dsRNA干扰实验。在不同时间点采集血液、鳃和肾组织样品，用于后续分析。

2.5. 渗透压、离子浓度分析

使用冰点渗透压计测定血清渗透压，使用商用检测试剂盒和酶标仪测定Na⁺和Ca²⁺浓度。

2.6. 组织酶活性分析

测定鳃和肾组织中Na⁺/K⁺-ATP酶(NKA)、Ca²⁺-ATP酶和钙调神经磷酸酶(CaN)的活性。所有测定均在最优底物和离子条件下进行，检测组织匀浆中相关酶的最大水解活性。

2.7. 总RNA提取、cDNA合成和qRT-PCR分析

使用TRIzol试剂从鳃和肾组织中提取总RNA，并反转录为cDNA。使用设计的引物和实时荧光定量PCR系统，检测trpc3及相关基因（如nka beta 1b subunit, nkcc1 variant X1, plcxd1, calm1a, aqp3a, hsp70, IL-1β等）的表达水平，以actb2作为内参基因，采用2^?ΔΔCT法计算相对表达量。

2.8. 统计分析

数据以平均值±标准差表示。采用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey's HSD检验进行组间差异比较。p < 0.05被认为具有统计学显著性。

3. 结果

3.1. 草鱼trpc3 cDNA序列分析与系统发育树

草鱼trpc3 cDNA全长为3421 bp，其2754 bp的开放阅读框编码一个917个氨基酸的蛋白质。亮氨酸(Leu)含量最高(11.6%)，色氨酸(Trp)最低(1.3%)。预测的TRPC3蛋白分子量为105.46 kDa。亚细胞定位分析表明其有27%的概率定位于质膜。保守结构域分析确定了锚蛋白(ANK)重复序列、TRP_2结构域和一个跨膜区。系统发育分析显示，草鱼trpc3与鲤科鱼类同源性最高，与哺乳动物和鸟类的同源性较低，其进化位置与传统分类学一致。

3.2. 草鱼trpc3 mRNA的组织表达分布

qRT-PCR组织表达分析显示，trpc3在草鱼各组织中普遍表达但水平各异。在脑中表达量最高，在鳃、皮肤和肌肉中表达量相对较高，在肠、肾、肝、脾和心中表达量较低。

3.3. 不同盐度胁迫下草鱼trpc3 mRNA表达的变化

暴露1天后，草鱼鳃和肾中trpc3的表达随盐度增加而升高。在4、7和10 ppt盐度下，其表达量均显著高于对照组(0 ppt)。在鳃组织中，其表达量分别为对照组的1.74、2.66和2.49倍；在肾组织中，分别为对照组的1.18、1.90和2.46倍。

3.4. trpc3-dsRNA干扰效率

评估了trpc3-dsRNA在草鱼鳃组织中的干扰效率。注射所有测试浓度(1、2和4 μg/g)的trpc3-dsRNA均能显著降低trpc3表达，其中注射后第1天表达水平最低。2 μg/g和4 μg/g组的trpc3表达显著低于1 μg/g组，但两者间无显著差异。干扰效率约为85%。基于此，选择2 μg/g浓度进行后续实验。

3.5. 血清渗透压和离子浓度

在盐胁迫下，SW+NS组(盐水+生理盐水组)在第1天血清渗透压和Na⁺浓度较对照组显著升高，Ca²⁺浓度在第3天显著升高。到第5天，Na⁺浓度和渗透压显著下降，而Ca²⁺浓度保持稳定。在SW+dsRNA组(盐水+dsRNA干扰组)中，血清渗透压随时间持续升高，到第5天也未出现下降趋势，且是SW+NS组的1.14倍。Na⁺浓度在第1天显著升高，到第5天下降，但仍显著高于SW+NS组。Ca²⁺浓度显著高于对照组，但与SW+NS组相比无显著差异。+ concentration and (C) Ca²⁺concentration in grass carp from different treatment groups.">

3.6. 鳃和肾中的酶活性

SW+NS组鳃和肾中CaN、NKA和Ca²⁺-ATP酶的活性均较对照组显著升高。虽然到第5天这些活性显著下降，但仍高于对照组。在SW+dsRNA组中，鳃CaN、NKA和Ca²⁺-ATP酶活性分别是SW+NS组的0.88、0.84和0.87倍。肾CaN和Ca²⁺-ATP酶活性分别是SW+NS组的0.92和0.90倍。这些活性均显著低于SW+NS组，但在盐胁迫期间仍高于对照组。肾NKA活性在SW+dsRNA组中表现出不同的模式：在第1天与SW+NS组相当，在第3天显著高于SW+NS组，到第5天下降但仍显著高于SW+NS组。2+-ATPase enzyme activity in the gills. (F) Ca²⁺-ATPase enzyme activity in the kidney.">

3.7. 不同处理组草鱼鳃组织中离子转运、细胞信号、炎症和应激反应基因的表达水平

在盐胁迫初期，SW+NS组鳃中trpc3、plcxd1、calm1a、aqp3a、nka beta 1b subunit、nkcc1 variant X1、IL-1β和hsp70的表达均较对照组显著上调。到第5天，部分基因表达下降但仍高于对照，calm1a则随时间增加。在SW+dsRNA组中，干扰初期，trpc3、calm1a、aqp3a、nka beta 1b subunit、nkcc1 variant X1、IL-1β和hsp70的表达均较SW+NS组显著降低。随着干扰时间延长，这些基因的表达普遍恢复。值得注意的是，plcxd1在SW+dsRNA组干扰初期的表达显著高于SW+NS组，随后下降，到第5天与SW+NS组相当但仍高于对照。

3.8. 不同处理组草鱼肾组织中离子转运、细胞信号、炎症和应激反应基因的表达水平

在盐胁迫初期，SW+NS组肾中trpc3、plcxd1、calm1a、aqp3a、nka beta 1b subunit、nkcc1 variant X1、IL-1β和hsp70的表达均较对照组显著上调。部分基因表达后期下降但仍高于对照，calm1a和IL-1β则随时间增加。在SW+dsRNA组中，干扰初期，trpc3、calm1a、aqp3a、nka beta 1b subunit、IL-1β和hsp70的表达较SW+NS组显著降低。随着干扰时间延长，基因表达普遍上调。到第5天，hsp70表达与SW+NS组持平；trpc3、nka beta 1b subunit和nkcc1 variant X1表达超过SW+NS组；而calm1a、aqp3a和IL-1β表达仍低于SW+NS组。与鳃组织类似，肾plcxd1在干扰初期的表达也显著高于SW+NS组。

4. 讨论

盐度是影响鱼类生理的主要非生物因子。TRPC3作为非选择性阳离子通道，调节Ca²⁺信号，参与多种生理过程。本研究通过腹腔注射dsRNA敲低盐胁迫下草鱼的trpc3表达以探究其功能。

在胁迫第1天，SW+NS组和SW+dsRNA组的血清渗透压、Na⁺和Ca²⁺变化趋势相似，表明对盐度的初始感知和响应并非仅由trpc3通路介导。到第5天，SW+NS组的血清渗透压和Na⁺显著下降，趋向对照水平，表现出自我调节的稳态恢复能力。而SW+dsRNA组的渗透压未下降，Na⁺下降延迟，Ca²⁺水平稳定。这表明正常草鱼可恢复稳态，但trpc3功能受损会损害这种恢复能力，凸显了其在盐胁迫期间内在稳态调节中的关键作用。

鳃是直接接触水生环境的主要渗透调节器官。在此过程中，Na⁺/K⁺-ATP酶(NKA)是介导渗透调节的关键膜蛋白。Ca²⁺-ATP酶通过排出Ca²⁺或将其隔离到内质网来维持细胞内低游离Ca²⁺水平。钙调神经磷酸酶(CaN)是一种Ca²⁺/钙调蛋白(CaM)依赖性磷酸酶，是钙信号传导的关键下游效应因子。本研究中，在胁迫第1天，SW+NS组草鱼鳃中NKA、Ca²⁺-ATP酶和CaN的活性显著升高。同时，钙信号通路基因(plcxd1, trpc3, calm1a)、效应因子基因(aqp3a, nka beta 1b subunit, nkcc1 variant X1)以及炎症/应激标记基因(IL-1β/hsp70)的表达协同上调。到第5天，这些酶活性和基因表达水平适度下降但仍高于对照组。这表明盐度刺激了TRPC3通路，激活了离子转运酶并引发了应激反应。然而，随着暴露时间延长，鱼体开始通过自我调节建立新的稳态。

在敲低trpc3的SW+dsRNA组中，这种稳态重建过程被破坏。干扰初期，被抑制的trpc3表达中断了依赖的Ca²⁺内流信号。钙结合的减少进而抑制了下游关键钙信号基因calm1a的表达，导致核心离子转运基因(nka beta 1b subunit, nkcc1 variant X1, aqp3a)和应激标记基因(IL-1β, hsp70)的下调。这些水平均显著低于SW+NS组。同时，尽管干扰组鳃NKA、Ca²⁺-ATP酶和CaN的活性初期升高，但始终显著低于SW+NS组。这些结果表明，trpc3通过介导钙信号来影响鱼类的离子转运能力和应激恢复力。面对trpc3干扰和钙信号阻断，鱼体激活了补偿机制。这主要表现为SW+dsRNA组plcxd1基因表达显著高于SW+NS组。这可能是因为当TRPC3介导的Ca²⁺内流受限时，细胞试图增强TRPC3通路上游的PLC活性，以产生更多的IP₃和DAG。IP₃可动员内质网中的钙库，而DAG可能直接激活其他DAG敏感的TRPC通道(如TRPC6)进行补偿。随着盐胁迫和干扰时间的延长，SW+dsRNA组的基因表达普遍恢复。值得注意的是，nka beta 1b subunit和nkcc1 variant X1的表达在胁迫第5天甚至达到或超过了SW+NS组的水平，这表明在TRPC3通路长期故障的情况下，通过替代途径启动了适应性基因表达。然而，这种补偿未能建立新的稳态。一方面，核心钙信号基因calm1a和应激指示基因hsp70的表达始终未达到SW+NS组的水平。另一方面，尽管关键离子转运酶NKA的活性在基因表达上调的驱动下有所恢复，但仍未达到SW+NS组的水平。

肾脏是鱼类排泄和调节体内稳态的重要器官，并不直接暴露于环境盐度。本研究中，SW+dsRNA组的肾脏反应与鳃不同。与trpc3敲低后鳃NKA、Ca²⁺-ATP酶和CaN活性全面受抑制不同，干扰组肾NKA活性初期与SW+NS组相当，在胁迫第3天显著高于SW+NS组，尽管后期下降但仍保持较高水平。这一模式在基因水平上得到呼应，SW+dsRNA组肾nka beta 1b subunit和nkcc1 variant X1的表达在盐胁迫第3天超过了SW+NS组。这些结果表明，当TRPC3通路被破坏，导致血清渗透压和离子浓度升高时，肾脏在增强离子重吸收和排泄以维持体内稳态方面表现出比鳃更强的代偿能力。SW+dsRNA组肾plcxd1表达显著升高也支持这一解释。肾脏也可能激活非TRPC途径来调节离子转运基因及相关酶活性的表达，以促进新稳态的建立。trpc3干扰后，鳃和肾脏对盐胁迫的响应模式不同，很可能源于它们不同的生理作用。鳃直接暴露于高渗环境，需要一个快速且协调的响应，该过程严重依赖TRPC3介导的Ca²⁺信号，因此更易受到破坏。相比之下，肾脏不直接接触环境，基于全身稳态进行更精细的调节，并且具有更强的激活替代补偿途径的能力。

5. 结论

总之，腹腔注射dsRNA有效敲低了盐胁迫下草鱼的trpc3基因。通过对血清渗透压、离子浓度以及鳃和肾组织中关键离子转运和钙信号基因的活性和表达水平的比较分析，我们阐明了trpc3基因的功能和机制。我们的结果表明，它主要感知盐度变化，并可能通过介导Ca²⁺内流来协调渗透调节组织中的离子转运，从而驱动鱼类渗透稳态的恢复。