《Microbiology Spectrum》：Metagenomic sequencing reveals viral diversity of mosquitoes from Egypt: co-circulation of multiple insect-specific viruses
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本研究利用宏基因组测序全面解析了埃及三种重要蚊种携带的RNA病毒组，首次系统揭示了该地区蚊媒病毒的多样性与共循环格局，发现了包括库蚊黄病毒（CxFV）在内的多种昆虫特异性病毒（ISVs），并鉴定出10个可能的新病毒，为埃及乃至中东、非洲地区的蚊媒病毒监测、演化研究及潜在生物防控应用提供了重要的基础数据。
引言
蚊媒病毒对全球公共卫生构成重大威胁，每年导致超1亿人感染。作为虫媒病毒的主要传播媒介，蚊子可传播登革热、寨卡、西尼罗河热和裂谷热等多种高致病性病原体。虫媒病毒在自然界中通过节肢动物媒介（如蚊、蜱、蠓）与易感脊椎动物宿主之间的循环传播而持续存在。埃及地处非洲东北部，是连接亚洲、欧洲和非洲的地理枢纽，其独特的地理位置使得蚊媒病毒的监测变得复杂。目前，埃及已报道至少五种具有临床意义的蚊媒病毒，但针对野外蚊群携带的虫媒病毒多样性的系统性研究仍较为缺乏。随着高通量测序技术的发展，宏基因组测序已成为一种强大的非靶向工具，非常适合用于病毒发现和描绘蚊媒携带的病毒谱。本研究旨在利用宏病毒组测序，对来自埃及三个关键区域的蚊虫进行RNA病毒组分析，以阐明相关病毒的遗传多样性和进化关系。
材料与方法
本研究在埃及战略要地持续开展蚊虫监测，共采集了包括伊蚊属和库蚊属在内的654份蚊虫样本。样本来自大开罗及尼罗河谷-三角洲、尼罗河谷-上埃及以及红海三个地区的六个省份。根据蚊种、性别和采样地点，将样本分为14个蚊池进行后续分析。
RNA提取使用MagNA Pure 96系统自动化完成。通过RT-PCR验证蚊池RNA完整性，并利用特异性PCR检测黄病毒、甲病毒和布尼亚病毒的部分基因。为富集病毒RNA，首先使用核糖体RNA去除试剂盒处理样本，随后进行RNA片段化、cDNA合成，并构建Illumina兼容文库，在NovaSeq平台上进行150 bp双端测序。
生物信息学分析方面，原始测序数据经质控后，过滤掉宿主和细菌来源的序列，得到高质量clean reads。使用SPAdes和SOAPdenovo-Trans进行de novo组装，获得病毒重叠群。利用CheckV软件和BLAST比对进行病毒鉴定与分类注释，新病毒物种的界定遵循国际病毒分类委员会标准。通过RPKM值量化病毒丰度，并使用Shannon指数、主坐标分析和线性判别分析效应大小等方法，比较不同地区组间病毒组的多样性和组成差异。系统发育树使用MEGA软件基于邻接法构建。
结果
埃及蚊虫的宏基因组分析
对14个蚊池的测序产生了超过6.77亿条原始读长，经质控和宿主序列去除后，获得约6194万条高质量读长用于分析。最终，研究鉴定出3139个病毒重叠群，归属于35个病毒科或未分类病毒组。病毒覆盖度平均为9.15%。
研究在埃及蚊虫中发现了超过130种病毒，其中弹状病毒科、幻影病毒科、线粒体病毒科、双分病毒科、番茄丛矮病毒科和全病毒科的病毒在各蚊池中分布广泛。值得注意的是，瓜德罗普库蚊弹状病毒、库蚊幻影样病毒、库蚊布尼亚样病毒2等五种病毒在几乎所有蚊池中均有检出。
病毒组成在蚊种间存在差异：在库蚊池中，大部分病毒重叠群属于弹状病毒科、黄病毒科、传染性软化病毒科和幻影病毒科，物种水平分析显示其主要对应瓜德罗普库蚊弹状病毒、库蚊黄病毒、传染性软化病毒和库蚊幻影样病毒。在Aedes caspius池中，优势病毒重叠群同样主要来自弹状病毒科、黄病毒科和幻影病毒科。在Cx. perexiguus池中，高比例的病毒重叠群属于弹状病毒科和全病毒科。
系统发育分析
PCR筛查在红海地区的一只野生库蚊复合体蚊虫中鉴定出一株库蚊黄病毒。对其部分NS5基因片段的系统发育分析显示，该埃及毒株与来自沙特阿拉伯吉达的库蚊黄病毒分离株亲缘关系最近。随后，通过宏病毒组测序获得了该埃及库蚊黄病毒毒株的近乎全基因组序列。
在另外四个蚊池中也通过测序检测到库蚊黄病毒序列，这些埃及序列与来自沙特阿拉伯的毒株序列相似性最高。基于近乎全长基因组序列构建的系统发育树形成了两个高支持度的单系群。分支1包含来自亚洲和美国的毒株，分支2则包含来自加勒比地区、非洲和拉丁美洲的毒株。本研究中鉴定的所有库蚊黄病毒序列均位于分支2内。
此外，研究还在蚊虫样本中检测到Kustavi全病毒样病毒、Hanko全病毒5、库蚊幻影样病毒、库蚊传染性软化样病毒1、库蚊传染性软化样病毒4、瓜德罗普库蚊弹状病毒以及砂拉越病毒等多种昆虫特异性病毒，并分析了它们的系统发育关系，揭示了它们与来自中东、欧洲、大洋洲和亚洲的病毒基因组序列具有最近的进化亲缘性。
推定新病毒的注释与系统发育分析
本研究共鉴定出10个推定的新病毒，它们分属于七个病毒科。基于氨基酸序列和基因组序列构建的系统发育树揭示了这些来自七个病毒科的推定新病毒的系统发育关系。这些病毒的基因组结构图也被展示。
这些病毒包括：在库蚊复合体中发现的属于融合病毒科的一种推定新型植物RNA病毒Qalyubia融合样病毒1；属于金色病毒科的埃及金色样病毒；属于线粒体病毒科的埃及线粒体样病毒1和2；属于全病毒科的埃及全病毒样病毒1和埃及新全病毒样病毒1；属于杆状病毒科的埃及相关杆状样病毒1和埃及奥巴莫样病毒1；属于线形病毒科的埃及线形病毒科sp.1；以及属于正粘病毒科的埃及相关正粘样病毒1。其中，正粘病毒科的部分成员可感染哺乳动物等多种宿主，因此其发现具有重要的临床和流行病学意义。
GC、AS和RS组间蚊虫病毒组差异
基于香农指数和主坐标分析，结果显示在科级和物种水平上，大开罗及尼罗河谷-三角洲、尼罗河谷-上埃及以及红海这三个地区组间的病毒组多样性及群落结构均无显著统计学差异。
在科级水平上，有41.2%的检测病毒为三组所共有。而在物种水平上，病毒的重叠比例则显著降低，仅有8.6%的病毒为三组共有。线性判别分析效应大小分析在物种水平上识别出了一些组间特异性差异病毒，例如来自阿斯旺地区的蚊虫显著富集了双翅目相关病毒，但在科级水平上未发现显著的差异性标志病毒。
讨论
宏病毒组测序能够同时表征蚊虫RNA病毒组的丰度和多样性。本研究首次对埃及大部分地区的蚊虫病毒组进行了全面调查，证实了与埃及三种蚊虫相关的高度病毒多样性以及潜在病毒宿主的多样性。
研究发现埃及蚊虫中最主要的病毒科包括弹状病毒科、幻影病毒科、传染性软化病毒科、线粒体病毒科、黄病毒科和正粘病毒科，这与来自中国山东省的蚊虫病毒组报告的主要病毒科组成不同。研究鉴定出多种昆虫特异性病毒，如库蚊黄病毒、Kustavi全病毒样病毒、砂拉越病毒等。系统发育分析表明，这些昆虫特异性病毒与来自中东、欧洲、大洋洲和亚洲的病毒基因组序列具有最近的进化关系，提示了这些病毒的全球传播潜力和广泛的宿主范围。
值得注意的是，库蚊黄病毒在埃及的库蚊复合体和Ae. caspius中均有检出，且在阿斯旺地区的库蚊复合体中流行率很高，表明该病毒在该地区分布广泛。库蚊黄病毒可分为两个不同的基因型，本研究在埃及发现的毒株均属于热带谱系和分支2。库蚊黄病毒的存在可能意味着感染人兽共患蚊媒病毒（如西尼罗河病毒）的风险升高。砂拉越病毒也被在埃及蚊虫中鉴定，其基因组序列与日本的Shinobi四病毒高度相似，而后者已被证明可抑制黄病毒的复制。
本研究鉴定的10个推定新病毒分属七个病毒科，拓宽了我们对这些病毒科宿主范围的认识。例如，Qaluobiyah融合样病毒1属于融合病毒科，该科成员以往主要为植物病毒。埃及相关杆状样病毒1和埃及奥巴莫样病毒1属于杆状病毒科，该科已知仅由植物病毒组成，但本研究发现的病毒与来自真菌和海洋藻类的病毒序列聚类。对线形病毒科序列的分析表明，节肢动物可能是这些病毒的潜在宿主。而埃及相关正粘样病毒的发现，因其所属的正粘病毒科包含可感染脊椎动物（包括人类）的流感病毒，具有重要的临床和流行病学意义。
结论
通过对埃及采集的654只蚊虫进行总RNA测序，本研究鉴定出超过130种病毒，分属35个分类群。对三种媒介蚊虫病毒组的比较分析显示，尽管它们地理分布重叠，但其RNA病毒组在科级和物种水平上均存在差异，且在当前采样范围内，地理位置的差异也导致了病毒组成的变化。研究证实了多种昆虫特异性病毒在埃及蚊虫中的共循环现象。这些发现极大地扩展了我们对埃及已知和先前未表征的蚊媒病毒的认知，凸显了对埃及境内节肢动物病毒组进行更深入研究的必要性。未来，更详细的研究将有助于阐明埃及及其他非洲国家蚊子、病毒、宿主物种和环境之间复杂的关系，从而全面了解病毒传播动态，并有望开发出针对疾病传播蚊媒的新型生物防控工具。
